ТЕГИ
«Ферментные системы и технологии получения циклодекстринов»
«Ферментные системы и технологии получения циклодекстринов»
Исполнитель: ГОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств», Научный руководитель работы, д.б.н., проф. Грачева И.М. Ответственный исполнитель, д.т.н., проф. Иванова Л.А. В.н.с., д.т.н., проф. Борисенко Е.Г. С.н.с., к.т.н. Комбарова С.П. С.н.с., к.т.н. Войно Л.И. С.н.с., к.б.н. Бутова С.Н. С.н.с., к.т.н. Бучинский Г.А. С.н.с., к.т.н. Митерева В.В. Н.с. Филатова Г.Л. Инженер, аспирант Рыжова Н.В. Инженер, аспирант Строева С.С. Инженер, аспирант Кузнецова О.В. Инженер, аспирант Шагина С.Е. Лаборант Орлова Ю.В. Лаборант Бородина М.А. Лаборант Питкиева О.С. Лаборант Баранова А.В.
В рамках государственного контракта решены следующие задачи:
- Проведен экспресс-скрининг микроорганизмов, выделенных из природных мест обитания, позволивший получить продуктивные штаммы, синтезирующие ферменты циклодекстринглюканотрансферазы (ЦГТ-азы). Штаммы охарактеризованы по активности, специфичности, рН- и термостабильности;
— на основе выбранных высокопродуктивных бациллярных штаммов микроорганизмов разработаны новые конкурентоспособные технологии ферментных препаратов α- и β- ЦГТ-аз;
— создан генномодифицированный штамм гиперпродуцент β-ЦГТ-азы и оптимизированы условия его получения;
— предложены технологии получения α- и β- циклодекстринов ( ЦД) методом контролируемой химико-ферментативной конверсии с использованием новых комплексообразователей;
— разработаны способы получения комплексов включения α- и β- ЦД с лекарственными препаратами стероидной природы, витаминами, экстрактами ароматических трав;
— проведена апробация новых технологий в условиях опытных производств;
— охарактеризованы опытные образцы α- и β- ЦГТ-аз, ЦД и комплексов включений на их основе;
- созданы комплекты нормативно-технической документации: лабораторные регламенты и технические условия получения препаратов ферментов, ЦД и комплексов включений.
«Fermentation systems and the technology of obtaining cyclodekstrins». Within the framework state contract are solved the following problems:
— Is carried out the express-screening of the microorganisms, isolated from the natural places of inhabiting, made it possible to obtain productive strains, the synthesizing ferments cyclodekstringlyukanotransferase (CGT). Strains are described on the activity, specificity, pH- and thermo stability.
— on the basis of the selected highly productive bacillary strains microorganisms are developed the new competitive technologies of fermentation preparations α- and β- CGT;
— is created the genetic modified strain hyper-producer the β- CGT and the conditions for its obtaining are optimized;
— are proposed to the technology of obtaining and α- and β- cyclodekstrins (CD) by the method of the controlled chemically-fermentative conversion with the use of new complex-formative substance;
— are developed the methods of obtaining the complexes of α- and β- CGT with by the medicines of steroid nature, by vitamins, by the extracts of aromatic grasses;
— is carried out the approval of new technologies in the conditions of experimental productions;
— are described prototypes α- and β- CGT, CD and the complexes on their basis;
— are created the complete sets of the technical-normative documentation: laboratory regulations and the technical specifications of obtaining the preparations of ferments, CD and the complexes.
Таблица № 1
 |
Производство циклодекстринов сравнительно новое и активно развивающееся направление биотехнологии, основанное на микробиологических, химических и биохимических процессах.
Циклодекстрины (ЦД) относятся к макроциклическим соединениям углеводной природы, получаемым под действием на крахмал некоторых специфических ферментов микробного происхождения, объединенных под названием - циклодекстринглюкано-трансферазы (ЦГТ-азы).
ЦД являются представителями полимергомологического ряда с общей формулой (C6H10O5)n. Общим для них является наличие характерного циклодекстринового макроцикла, структурной единицей которого является α-D-глюкоза в пиранозной форме. Образование ЦД со степенью полимеризации меньше 6 по стерическим причинам невозможно. Наибольший практический интерес представляют три первых возможных гомолога с n=6,7,8, которые обладают фиксированной конформацией и обозначаются α- , β- и γ – ЦД.
Наиболее интересным и практически значимым свойством ЦД является способность образовывать комплексы включения с органическими и неорганическими соединениями типа «хозяин – гость», причем «хозяином» называют молекулы ЦД с внутренней гидрофобной полостью, а «гостем» – молекулу, которая входит в эту полость и задерживается там за счёт межмолекулярных сил.
В случае образования комплексов включения физические и химические свойства «гостей» могут значительно изменяться, что позволяет улучшать прикладные свойства комплексуемых веществ, например, увеличение растворимости в воде неполярных субстанций (10-100 раз); уменьшается летучесть легко испаряющихся органических жидкостей; увеличивается стабильность ингредиентов к воздействию кислорода, воздуха, света, температуры; пролонгируется действие активного начала; удаётся устранить или снизить побочные эффекты компонентов, такие как раздражающее действие, неприятный запах или вкус и многое другое.
Благодаря таким особенностям, сферы применения ЦД постоянно расширяются, а интересы исследователей разных стран и количество публикаций на эту тему постоянно увеличиваются. ЦД и комплексы на их основе находят применение в пищевой промышленности, в медицине и ветеринарии, в парфюмерии и косметологии, а также в области сельского хозяйства, биотехнологии и экологии, во многих аналитических процедурах, в области химических и других технологий, в тонком органическом синтезе, нефтедобыче.
Для выделения и очистки каждого гомолога циклодекстринового ряда (α, β, γ и др. ЦД) требуются различные подходы, но основные этапы получения ЦД схожи. К ним относятся:
— культивирование продуцентов ЦГТ-аз, выделение ферментов;
— получение препаратов ЦГТ-аз заданной степени очистки;
— предобработка субстрата (крахмала) ферментативным методом;
— ферментативный катализ с использованием ЦГТ-азы — реакция конверсии крахмала с образованием смеси ЦД;
— разделение, выделение и очистка одного из гомологов ЦД.
Основное производство и потребление ЦД сосредоточено в Японии, хотя технологиями по получению этих продуктов обладают фармацевтические фирмы Венгрии, Франции, Бельгии, а также США.[2] В настоящее время в России отсутствует производство ЦД .Поэтому исследование в области создания конкурентоспособных малоотходных технологий ферментных препаратов ЦГТ-аз, ЦД и комплексов включения на их основе являются актуальными.
Главными задачами настоящих исследований были:
1. Разработка новых конкурентоспособных технологий ферментных препаратов α – и β- ЦГТ-аз.
2. Создание генноинженерного штамма гиперпродуцента β-ЦГТ-азы.
3.Разработка технологии получения α – и β-ЦД методом контролируемой химико-ферментативной конверсии.
4. Разработка способов получения комплексов включения α –и β-ЦД с лекарственными препаратами стероидной природы, витаминами и экстрактами ароматических трав.
В результате проведенных исследований предложена и апробирована новая методика скрининга микроорганизмов, базирующаяся на использовании накопительных культур, выращенных на средах, содержащих α –и β- ЦД. Методика была успешно использована для проведения экспресс-скрининга 1650 образцов почвы, в результате которого выделено 55 изолятов, осуществляющих деструкцию крахмала. Осуществлена проверка изолятов на специфичность. Установлено, что 24 изолята являются β- ЦГТ-активными, 14 изолятов α –ЦГТ-активными, 17 изолятов обладают смешенной активностью. Разработанным методом ВЭЖХ исследованы 22 препарата β- ЦГТ-азы и 16 препаратов α –ЦГТ-азы. Выбраны активные штаммы-продуценты α – и β- ЦГТ-аз и проведена их идентификация. Оптимизированы условия культивирования штаммов Bacillus sp. 1 АМБ – продуцента α – ЦГТ-азы и Paenibacillus sp. ИБ-10168 – продуцента бета- ЦГТ-азы. Получена активность альфа-ЦГТ-азы 40-60 ед/см³, β-ЦГТ-азы 7-8 ед/см³. Оптимизированы условия ультрафильтрации, осаждения и сушки ферментных препаратов.Предложена технологическая схема получения ЦГТ-аз (рис.1 Технологическая схема получения препаратов ЦГТ-аз со степенью очистки Г20Х).
Таблица № 2
Наработаны образцы ферментных препаратов α – ЦГТ-аза Г10Х и Г20Х в лабораторных условиях и на стендовых установках НТЦ «Лекбиотех» и ОАО»Биохиммаш» и β- ЦГТ- азы Г20Х (Паенициклин Г20Х) на ГУП «Опытный завод» АН Республики Башкортостан. Активность препарата α – ЦГТ –азы Г20Х составила 3040 ед/г, выход по активности 65. 5%. Активность препарата бета- ЦГТ-азы- составила 1700ед/г, выход-57.6%. Полученные результаты легли в основу лабораторных регламентов и проектов ТУ на препараты α- и β- ЦГТ-аз. Образцы ферментных препаратов проверены на специфичность, рН- и термостабильность, определены оптимальные условия их действия.
Для создания генноинженерного штамма-гиперпродуцента β- ЦГТ-азы отобран штамм Bacillus sp.10155, из которого был выделен и секверирован ген, кодирующий 16s-RNA этого штамма, определены его нуклеотидная и соответствующая ей аминокислотная последовательности. Составлены генетическая и физическая карты плазмиды. Выбран штамм Escherichia coli BL21, синтезирующий РНК-полимеразу, на основе которого создан новый генноинженерный штамм – гиперпродуцент β-ЦГТ-азы. Оптимизированы условия культивирования этого штамма по температуре, составу среды и длительности инкубации , в результате активность фермента β-ЦГТ-азы была увеличена в 15 раз. Наработку опытного образца препарата генномодифицированной β-ЦГТ-азы осуществили на стендовой установке ЗАО»Биопрогресс» .
Разработаны технологии получения α- и β-ЦД (рис. 2. Принципиальная технологическая схема получения циклодекстринов).
Выбран вид крахмала и способ его подготовки. Предложены новые комплексообразователи для процесса сольвентно-контролируемой конверсии α- и β – ЦД . Разработаны ТУ на препараты α- и β- ЦД. Выход ЦД составил до 70% от массы крахмала. Достигнуто содержание α-ЦД и в β-ЦД в смеси-92-95%. Наработаны опытные партии α- и β- ЦД.
Получены сополимер β- ЦД с эпихлоргидрином, растворимость которого составила 200г/л и превысила растворимость немодифицированного бета- ЦД более, чем в 10 раз. Комплекс полиальдегида β- ЦД- хитозана (1:20) позволил увеличить растворимость гидрокортизона в 3 раза. Полученный сорбент кремнезем-бета- ЦД (1:1,4), способен сорбировать холестирин и может быть ипользован для его удаления из молочных продуктов. Созданные комплексы включения ЦД с витамином Е и β-каротином могут быть использованы для обогащения витаминами пищевых продуктов, комплексы экстрактов ароматических веществ – для получения порошкообразных растворимых ароматизаторов пищевых продуктов. Разработана препаративная форма элементной серы в комплексе с β-ЦД, обладающая истинной растворимостью в воде до 300мг на литр.
Элементная сера в комплексе с β-ЦД может быть использована в медицине для лечения кожных болезней и в сельском хозяйстве как средство защиты растений.
На основании проведенных исследований и полученных результатов были разработаны 2 лабораторных регламента, 6 проектов технических условий, опубликовано 11 статей, защищена в 2006 г. кандидатская диссертация,подготовлены к защите в 2007 г. 1 докторская и 2 кандидатских диссертации.
Выводы: ЖС-12.4/004 «Ферментные системы и технологии получения циклодекстринов» и перспективы дальнейшего использования.
Скрининг ЦГТ-активных изолятов для разработки промышленных продуцентов α- и β-ЦГТ-аз позволил создать региональную коллекцию микроорганизмов-продуцентов ЦГТ-аз в Башкортостане и коллекцию микроорганизмов на кафедре «Биотехнология» МГУПП для научно-исследовательских и учебных работ. Осуществлен подбор штаммов, перспективных для дальнейшей селекции. Культура B. species ИБ10155 была использована в качестве донора гена бета-ЦГТазы для создания генетически модифицированных продуцентов. Определены морфологические, культуральные и физиолого-биохимические и филогенетические характеристики нового галофильного штамма-продуцента α – ЦГТ азы , идентифицированного как Paenibacillus macerans, достигнутая активность α- ЦГТ-азы в составляет 60 ед/см3 КЖ. , β- ЦГТ-азы – 8 ед/см3 КЖ..
Определены оптимальные условия культивирования новых продуктивных штаммов. Разработана схема выделения и очистки ЦГТ-аз, включающая ультрафильтрацию, осаждение этанолом и лиофилизацию спиртоосажденного фермента. Оптимизированы все стадии технологического процесса. Результаты исследований легли в основу проектов технологических регламентов получения α- и β-ЦГТ-аз, на основе которых осуществлены наработки α-ЦГТ-азы на опытной установке ОАО «Биохиммаш» и β-ЦГТазы на ГУП «Опытный завод» в Уфе. На основе выделенного и секвенированного гена ЦГТ-азы из культуры B. species ИБ 10155 создан новый генномодифицированный штамм E.coli BL21 с активностью ЦГТ-азы 200 ед/см³ Полученный генноинженерный штамм был использован для наработки β-ЦГТ-азы в условиях опытного производства. Определены параметры конверсии крахмала в α - и β –ЦД в присутствии новых малотоксичных растворителей. Достигнутый уровень конверсии крахмала в процессе опытной лабораторной наработки ЦД ~70%. Подобраны оптимальные условия для сшивки β-ЦД с поливиниловым спиртом и кремнеземом. Изучены и подобраны оптимальные условия образования комплекса ПВС-СНО : β-ЦД с холестерином. Разработка может найти применение в молочной промышленности. Разработаны методики синтеза комплексов циклодекстринов с СО2 экстрактами пряно-ароматического природного сырья;с ванилином; бета-каротином с образованием стабильных водных суспензий; водорастворимых комплексов с элементной серой; холестерином; витамином Е (альфа-токоферол ацетатом); со стероидами: кортексолоном и гидрокортизоном.
Опубликованные разработки являются оригинальными и могут быть основой для создания новых пищевых добавок, фармакологических, ветеринарных и сельскохозяйственных препаратов. Разработана нормативно-техническая документация, проведена апробация технологий получения ЦГТ-аз и ЦД.
Перспективы дальнейшего использования:
— Методики скрининга микроорганизмов-продуцентов ЦГТ-аз могут быть использованы для поиска активных продуцентов других ферментов;
— созданные технологии могут применяться для промышленного получения препаратов α- и β- ЦГТ-аз и ЦД пищевой и фармакопейной градации;
— после апробации комплексов включения полимерных производных ЦД с витаминами и экстрактами ароматических веществ в пищевых технологиях будут разработаны рекомендации для предприятий пищевой промышленности;
- комплексы включений ЦД с лекарственными препаратами стероидной природы найдут применение в фармацевтике.
Литературные источники.
1. Абелян В.А. Циклодекстрины: получение и применение. Ереван, 2002.
2. Грачева И.М., Иванова Л.А. Биотехнология биологически активных веществ. – Москва, издательство НПО «Элевар», 2006.
 |
