ТЕГИ
Биосенсоры для экологического мониторинга на основе фотосинтетических пигмент-белковых комплексов.
«Биосенсоры для экологического мониторинга на основе фотосинтетических пигмент-белковых комплексов». Biosensors for environmental monitoring on the basis of photosynthetic pigment-protein complexes. Исполнитель: НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета, А.Ю. Семенов, В.А. Шувалов, М.Д. Мамедов, О.А. Гопта, А.А. Заспа, В.В. Птушенко, О.А. Кокшарова, Л.А. Витухновская, А.А. Тюняткина, А.М. Арутюнян, М.М. Мубаракшина, Т.А. Фуфина.
Соисполнители: Физический факультет МГУ: А.Н. Тихонов, Г.Б. Хомутов, А.А. Дементьев, Б.В. Трубицын, В.А. Караваев, М.К. Солнцев, Ю.А. Кокшаров; Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН О.М. Саркисов, В.А. Надточенко, А.Н. Петрухин, А.А. Титов, Ф.Е. Гостев, И.В. Шелаев.
Руководитель работы: зав. лабораторией, доктор биол. наук Семенов Алексей Юрьевич.
В ходе выполнения проекта был проведен цикл исследований фундаментального и поискового характера, направленных на выяснение физико-химических механизмов влияния поллютантов и других неблагоприятных факторов окружающей среды на функциональные характеристики фотосинтетического аппарата растений. Получены следующие научные и практические результаты, на основе которых был разработан прототип биосенсора для экологического мониторинга, содержащий фотосинтетические пигмент-белковых комплексы.
1. Установлены особенности молекулярного механизма ингибирования фотосинтетического переноса зарядов на акцепторных участках бактериальных фотосинтетических реакционных центров и фотосистемы 2 высших растений гербицидами и ионами тяжелых металлов. Изучено влияние различных экологических факторов на нефотохимическое тушение флуоресценции хлорофилла в листьях растений, мхах и лишайниках. Параметры флуоресценции хлорофилла у этих объектов могут быть использованы для экспресс-мониторинга экологической обстановки.
2. Исследованы биофизические характеристики пигмент-белковых комплексов фотосинтетического аппарата растений, регистрация которых может быть использована для экспресс-диагностики поллютантов и неблагоприятных факторов окружающей среды с помощью биосенсоров на основе фотосиснтетических пигмент-белковых комплексов. Показано, что методами ЭПР и люминесцентного анализа можно регистрировать изменения состояния фотосинтетического аппарата на ранних стадиях воздействия поллютантов на растения. Продемонстрирована возможность использования выделенных тилакоидов высших растений в качестве элемента биосенсора для экспресс-диагностики повышенных концентраций солей тяжелых металлов в среде произрастания.
3. Создан прототип биосенсора, содержащего в качестве рецепторного элемента фотосинтетические пигмент-белковые комплексы, чувствительного к присутствию загрязнителей (гербициды, ионы тяжелых металлов) в окружающей среде.
During implementation of this project a number of basic and applied research studies were performed. These studies were designed to elucidate the physico-chemical mechanisms of effects of pollutants and other adverse environmental factors on the functional characteristics of the photosynthetic apparatus of plants. The following scientific and practical results of the study provided a basis for constructing a prototype ecological monitoring biosensor containing photosynthetic pigment–protein complexes.
1. Molecular mechanisms of inhibition of photosynthetic charge transfer on the acceptor side of bacterial photosynthetic reaction centers and photosystem I of higher plants induced by herbicides and heavy metal ions were established. The effects of various ecological factors on the nonphotochemical chlorophyll fluorescence quenching in plant leaves, mosses, and lichens were studied. Parameters of chlorophyll fluorescence in these objects can be used for rapid ecological monitoring.
2. The biophysical parameters of the pigment–protein complexes of photosynthetic apparatus of plants were studied. The measurement of these parameters can be used for rapid diagnosis of pollutants and adverse environmental factors using biosensors containing photosynthetic pigment–protein complexes. It was shown that EPR and luminescence analysis could be used for monitoring changes in the photosynthetic apparatus state at early stages of exposure of plants to pollutants. It was demonstrated that isolated thylakoids of higher plants could be used as receptor elements of biosensors for rapid diagnosis of enhanced concentration of heavy metal ions in soil substrate.
3. A prototype biosensor based on photosynthetic pigment–protein complexes as receptor elements was constructed. The biosensor is designed to monitor environmental pollutants (herbicides, heavy metal ions).
Знание особенностей структурной и функциональной организации фотосинтетического аппарата является основой для создания систем, которые могут быть использованы в различных областях био- и нанотехнологии, в частности, для создания высокочувствительных биосенсоров. Целью данного проекта являлась разработка на основе фотосинтетических пигмент-белковых комплексов биосенсора, используемого в качестве датчика для экологического экспресс-мониторинга.
1. Первая часть работы по теме проекта была связана с циклом фундаментальных и поисковых исследований, направленных на выяснение механизмов влияния неблагоприятных факторов внешней среды (тяжелые металлы, загрязнения атмосферы и др.) на функционирование цепей электронного транспорта различных фотосинтезирующих организмов (высшие растения, мхи, лишайники, цианобактерии и пурпурные бактерии). Для исследования структурно-функциональных характеристик фотосинтетического аппарата были использованы прямой электрометрический метод, методы импульсной оптической спектроскопии, спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), люминесцентные методы (измерения квантового выхода флуоресценции, индукции флуоресценции и спектров термолюминесценции). Отметим, что ЭПР и люминесцентные методы исследования позволяют неинвазивным способом регистрировать неспецифические изменения, происходящих в фотосинтетическом аппарате высших растений под действием различных факторов внешней среды.
В ходе первого этапа работы были получены следующие результаты.
1.1. Установлены особенности молекулярного механизма ингибирования фотосинтетического переноса зарядов на акцепторных участках бактериальных фотосинтетических реакционных центров (РЦ) и фотосистемы 2 (ФС 2) высших растений гербицидами и ионами тяжелых металлов. Исследование влияния ионов тяжелых металлов на образование мембранного потенциала в протеолипосомах, содержащих комплексы ФС 2, показало, что ионы Cd2+ и Zn2+ ингибируют электрогенное протонирование, сопровождающее перенос электрона между первичным хинонным акцептором QA и атомом негемового железа Fe3+.
1.2. Изучено влияние различных экологических факторов на нефотохимическое тушение флуоресценции хлорофилла в листьях растений, мхах и лишайниках. Показано, что параметры флуоресценции хлорофилла у этих объектов могут быть использованы для экспресс-мониторинга экологической обстановки.
1.3. Исследована фемтосекундная динамика переноса энергии и первичного разделения зарядов в фотосистеме 1 (ФС 1) при её возбуждении импульсами света с длинами волн 680 нм, 700 нм и 720 нм с различной фазовой модуляцией фемтосекундного импульса возбуждения (чирпирование импульса). Показано, что изменение фазовой модуляции наиболее значительно влияет на кинетику первичной стадии переноса электрона в РЦ ФС 1 и, возможно, на перенос энергии возбуждения в примыкающих к РЦ молекулах хлорофилла антенны.
1.4. На пигмент-белковых комплексах ФС 1 цианобактерий обнаружен эффект осцилляций в кривых затухания поглощения после возбуждения фемтосекундным импульсом. Исследование динамики осцилляций дает возможность исследовать тонкие эффекты динамики передачи энергии и переноса заряда в фотосинтетическом аппарате.
2. Одним из наиболее перспективных подходов для детектирования загрязнений в окружающей среде с помощью биосенсоров, построенных на основе пигмент-белковых комплексов, является регистрация их люминесцентных характеристик. Флуоресценция хлорофилла, входящего в состав фотосинтетических пигмент-белковых комплексов, зависит от редокс состояния переносчиков фотосинтетической электрон-транспортной цепи (ЭТЦ). Токсичные соединения, ингибирующие перенос электронов на разных участках ЭТЦ, могут различным образом влиять на спектральный состав и кинетику выхода флуоресценции. В интактных фотосинтетических системах заметное влияние на кинетику этого процесса оказывают процессы, протекающие с участием ФС 2, цитохромного b6f-комплекса, ФС 1 и ферментов цикла Кальвина. Особое значение имеет влияние загрязняющих веществ на процессы переноса электронов с участием хинонных акцепторов в РЦ ФС 2.
На втором этапе работы были исследованы биофизические характеристики пигмент-белковых комплексов фотосинтетического аппарата растений, регистрация которых может быть использована для экспресс-диагностики поллютантов и неблагоприятных факторов окружающей среды с помощью биосенсоров на основе фотосиснтетических пигмент-белковых комплексов. Основные результаты этого этапа работы заключаются в следующем.
2.1. Изучено влияние экологических факторов (загрязнение атмосферы выхлопными газами, гербицидами и тяжелыми металлами) на функциональное состояние листьев высших растений. Показано, что методами ЭПР и люминесцентного анализа (измерения спектров термолюминесценции и кинетики выхода флуоресценции) можно регистрировать изменения фотосинтетического аппарата на ранних стадиях воздействия поллютантов на растения. Путем измерения квантового выхода фотосинтеза с помощью мини ПАМ-флуориметра показано, что листья растений являются хорошим индикатором для регистрации загрязнения почвы солями тяжелых металлов.
2.2. Показано, что при обработке растений солями тяжелых металлов и гербицидами наблюдаются специфические изменения в фотосинтетическом аппарате: при относительно низких концентрациях солей (10-7 — 10-6 М) наблюдается активация фотосинтетических процессов, а при более высоких концентрациях (10-4 — 10-3 М) происходит заметное подавление фотосинтетической активности. Таким образом, была продемонстрирована возможность использования выделенных тилакоидов высших растений в качестве элемента биосенсора, служащего для экспресс-диагностики присутствия повышенных концентраций солей тяжелых металлов в среде произрастания растений.
2.3. Выведено уравнение для определения квантового выхода первичных стадий фотосинтеза на основе измерения флуоресцентных характеристик зеленых растений, водорослей и цианобактерий.
2.4. Разработана математическая модель, устанавливающая связь между кинетическими параметрами световых стадий фотосинтеза, измеряемых биофизическими методами (оптическая и ЭПР-спектроскопия, регистрация люминесцентных характеристик фотосинтетических систем) и функциональным состоянием фотосинтетического аппарата.
3. На третьем этапе работы был выполнен цикл исследований по созданию прототипа биосенсора (датчика), содержащего в качестве рецепторного элемента фотосинтетические пигмент-белковые комплексы, чувствительные к присутствию загрязнителей (гербициды, ионы тяжелых металлов) в окружающей среде.
Анализ полученных результатов показал, что все использованные в работе инструментальные методы диагностики функционального состояния фотосинтетического аппарата растений могут быть использованы для экологического мониторинга в лабораторных (ЭПР, термолюминесценция, электрометрия) или в полевых (флуориметрия) условиях. Для проведения экспресс-диагностики в полевых условиях представляется наиболее целесообразным использовать портативные флуориметры, с помощью которых можно считывать информацию в виде параметров флуоресценции хлорофилла, испускаемой специальным датчиком (биосенсором).
Основные результаты третьего этапа работы могут быть суммированы следующим образом.
3.1. Разработан макет биосенсорного флуориметра для регистрации изменений выхода флуоресценции в зависимости от наличия загрязнителей в окружающей среде.
3.2. Создан прототип биосенсора, содержащего в качестве рецептора фотосинтетические реакционные центры, чувствительные к присутствию загрязнителей (гербициды, ионы тяжелых металлов) в окружающей среде. В качестве такого биосенсора были выбраны хлоропласты высших растений, иммобилизованные на твердой подложке с помощью полиэлектролитов или инкапсулированные в составе геля. Методом ЭПР было показано, что иммобилизованные таким образом хлоропласты сохраняют фотосинтетическую активность при хранении при температуре 4оС.
3.3. Подана заявка на изобретение способа получения тонкопленочного материала, содержащего функциональные компоненты и молекулы полиэлектролитов. Предложенный тонкопленочный материал сформирован на поверхности подложки и включает предварительно сформированные поли-ионные комплексы молекул поликатионов, полианионов и функциональных компонентов (например, фотосинтетических пигмент-белковых комплексов). Данное изобретение обеспечивает эффективное сохранение нативности и активности фотосинтетических пигмент-белковых комплексов и может быть использовано в качестве стабильного биосенсора, необходимого для экологического экспресс-мониторинга. Кроме этого, данное изобретение может использоваться в сенсорных, аналитических, диагностических, медицинских, косметических, биокаталитических и биоэлектронных устройствах и системах, в устройствах и технологиях мониторинга и прогнозирования состояния атмосферы и гидросферы, а также альтернативной и возобновляемой энергетики.
Выводы и перспективы: Получены следующие научные и практические результаты, на основе которых был разработан прототип биосенсора для экологического мониторинга, содержащий фотосинтетические пигмент-белковых комплексы.
1. Выполнен цикл исследований, направленных на выяснение механизмов влияния поллютантов и других неблагоприятных факторов окружающей среды на функциональные характеристики фотосинтетического аппарата растений и фотосинтезирующих бактерий. Установлены особенности молекулярного механизма ингибирования фотосинтетического переноса зарядов на акцепторных участках бактериальных фотосинтетических реакционных центров и фотосистемы 2 высших растений гербицидами и ионами тяжелых металлов. Изучено влияние различных экологических факторов на нефотохимическое тушение флуоресценции хлорофилла в листьях растений, мхах и лишайниках. Параметры флуоресценции хлорофилла у этих объектов могут быть использованы для экспресс-мониторинга экологической обстановки.
2. Исследованы биофизические характеристики пигмент-белковых комплексов фотосинтетического аппарата растений, регистрация которых может быть использована для экспресс-диагностики поллютантов и неблагоприятных факторов окружающей среды с помощью биосенсоров на основе фотосиснтетических пигмент-белковых комплексов. Показано, что методами ЭПР и люминесцентного анализа можно регистрировать изменения состояния фотосинтетического аппарата на ранних стадиях воздействия поллютантов на растения. Продемонстрирована возможность использования выделенных тилакоидов высших растений в качестве элемента биосенсора для экспресс-диагностики повышенных концентраций солей тяжелых металлов в среде произрастания.
3. Создан прототип биосенсора, содержащего в качестве рецепторного элемента фотосинтетические пигмент-белковые комплексы, чувствительного к присутствию загрязнителей (гербициды, ионы тяжелых металлов) в окружающей среде.
Целесообразно продолжить изучение молекулярных механизмов фотосинтеза, в частности, для расширения возможности детекции большего числа загрязнителей окружающей среды путем регистрации кинетики и квантового выхода флуоресценции с помощью биосенсоров на основе фотосинтетических пигмент-белковых комплексов
Предполагается также продолжить работу по совершенствованию разработанного прототипа биосенсора для детектирования загрязнений окружающей среды в лабораторных и полевых условиях.
