растворы для микробиологии, микробиология

Методы приготовления препаратов для микроскопии, микробиология

• 08 января 2009
• микробиология иммунология бактерия возбудитель вирусология эпидемиология микроскопия суспензия фиксатор

Методы приготовления препаратов для микроскопии, микробиология Микроскопия Изучение морфологии и строения клеток микроорганизмов, величина которых измеряется в большинстве случаев микрометрами (1 мкм = = 10 мм =10 м), возможно только с помо...

Лабораторная работа № 1. Оборудование микробиологической лаборатории и подготовка посуды к стерилизации, микробиология

• 07 января 2009
• микробиология иммунология бактерия возбудитель вирусология эпидемиология лабораторная работа стерилизация

Лабораторная работа № 1. Оборудование микробиологической лаборатории и подготовка посуды к стерилизации, микробиология Цель работы. Ознакомление с правилами работы в микробиологической лаборатории, с особенностями подготовки помещения, обор...

Методы стерилизации питательных сред и посуды, микробиология

• 05 января 2009
• микробиология иммунология бактерия возбудитель вирусология эпидемиология автоклав стерилизация пастеризация

Методы стерилизации питательных сред и посуды, микробиология / Methods of sterilization of nutrient media and dishes, microbiology Стерилизация является одним из важнейших и необходимых приемов в микробиологической практике. Слово &laq...

Микробиологическая лаборатория и правила работы в ней, микробиология

• 04 января 2009
• микробиология иммунология бактерия возбудитель вирусология эпидемиология дезинфекция ультрафиолет пипетка

Внимание! В учебных заведениях не разрешается работать с живыми патогенными микроорганизмами. Необходимо помнить, что при посеве сапрофитных микроорганизмов из окружающей среды случайно может быть внесена и патогенная микрофлора. Работа с с...

Общая часть, микробиология

• 03 января 2009
• микробиология иммунология бактерия возбудитель вирусология эпидемиология

Общая часть, микробиология

Необходимо помнить, что при посеве сапрофитных микроорганизмов из окружающей среды случайно может быть внесена и патогенная микрофлора. Работа с сапрофитными бактериями в ряде случаев требует абсолютной стерильности для получения надежных результатов опыта. В микробиологической практике используют главным образом чистые культуры микроорганизмов. Культуру, содержащую микроорганизмы одного вида, называют чистой. Если в культуре содержится более одного вида микроорганизмов, она носит название смешанной.

Микробиологическая лаборатория включает ряд помещений, где проводят работу с микроорганизмами или подготовку к ней. Поверхность столов и пол всех лабораторных помещений покрывают легко моющимся материалом. В основном рабочем помещении находятся аппаратура, посуда и реактивы. Столы имеют подводку электроэнергии и снабжены газовыми горелками.

Стерилизационная: автоклавы, сушильные шкафы, термостаты, холодильная комната

Кроме основного рабочего помещения лаборатория имеет стерилизационную, где размещено лабораторное оборудование и приборы автоклавы и сушильные шкафы, бокс, моечную, холодильную комнату, термостаты или термостатированные комнаты для выращивания микроорганизмов, помещение для хранения культур и т.д.

Подготовка микробиологической лаборатории к работе Для того чтобы снизить количество микроорганизмов в воздухе и на различных поверхностях, в лабораторных помещениях применяют различные способы дезинфекции. Слово «дезинфекция» означает обеззараживание, то есть уничтожение возбудителей инфекционных болезней на объектах внешней среды.

Помешение микробиологической лаборатории

Пол, стены и мебель в микробиологической лаборатории протирают растворами различных дезинфицирующих веществ

Для проведения дезинфекции помешения можно применять готовые растворы или приготовить самим. Следующие пропорции

Воздух дезинфицировать проветриванием

Воздух в лаборатории наиболее просто дезинфицировать проветриванием. Продолжительная вентиляция помещения через форточку (не менее 30-60 мин) приводит к резкому снижению количества микроорганизмов в воздухе, особенно при значительной разнице в температуре между наружным воздухом и воздухом помещения. Более эффективный и наиболее часто применяемый способ дезинфекции воздуха - облучение ультрафиолетовыми лучами с длиной волны от 200 до 400 нм. Ультрафиолетовые лучи обладают слабой проникающей способностью, поэтому в зависимости от степени загрязненности воздуха для его стерилизации требуется облучение от 30 мин до нескольких часов.

Бактерицидная лампа и ультрафиолетовые лучи

Необходимо иметь в виду, что ультрафиолетовые лучи могут вызвать тяжелые поражения глаз. Поэтому при работе с бактерицидными лампами нужно строго следить за тем, чтобы ни прямые, ни отраженные ультрафиолетовые лучи не попадали в глаза.

Рабочее место, где непосредственно проводится работа с культурами микроорганизмов, требует особенно тщательной обработки.

Рабочий стол следует дезинфицировать не только до начала работы, но и после ее окончания. Для протирания поверхности стола можно использовать растворы лизола и хлорамина, а также 70%-ные (по объему) растворы изопропилового или этилового спиртов.

В лаборатории не разрешается курить, хранить и употреблять еду, напитки, жевательную резинку.

Рабочим специалистам и лаборантам необходимо работать в халатах.

Правила работы с культурами микроорганизмов

В лаборатории микроорганизмы выращивают в питательных средах, которые разливают в пробирки, колбы, матрацы и чашки Петри.

Посев или инокуляцией внесение микроорганизмов

Внесение микроорганизмов в стерильную среду называется посевом, или инокуляцией. Перед посевом следует тщательно надписать на пробирке (колбе или чашке Петри) название микроорганизма и дату посева. Надпись делают маркером на стекле или на наклеенной этикетке. Клетки микроорганизмов для посева или приготовления препаратов берут бактериологической петлей, если микроорганизмы выращены на плотной среде.

В том случае, когда пересевают культуры микроорганизмов, выросшие в жидкой питательной среде, пользуются стерильной пипеткой. Использованную пипетку следует немедленно перенести в дезинфицирующий раствор, например 3 - 5%-ный водный раствор фенола или 2%-ный раствор хлорамина, не касаясь ею окружающих предметов.

Все манипуляции при посеве следует проводить около пламени горелки (но не в пламени).

Методы стерилизации питательных сред и посуды, микробиология / Methods of sterilization of nutrient media and dishes, microbiology

Стерилизация является одним из важнейших и необходимых приемов в микробиологической практике. Слово «стерилизация» в переводе с латинского означает обеспложивание. В практической работе под стерилизацией понимают методы, применяемые для уничтожения всех форм жизни как на поверхности, так и внутри стерилизуемых объектов. Различают термическую и холодную стерилизацию. Способы термической стерилизации: прокаливание в пламени и обжигание, сухожаровая стерилизация (горячим воздухом), стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование), дробная стерилизация (тиндализация), кипячение. Методы холодной стерилизации: стерилизация фильтрованием, газообразными средствами, ультрафиолетовыми лучами и другими видами излучений.

Физико-химические свойства материала и стерилизация / Physical and chemical properties of the material and sterilization

Возможность и целесообразность применения того или иного способа определяется в первую очередь физико-химическими свойствами материала, подлежащего стерилизации, а иногда и целью исследования.

Стерилизация питательных сред насыщенным паром под давлением (автоклавирование) Совместное действие высокой температуры и давления пара обеспечивает особую эффективность данного способа (табл. 1).

Таблица 1

Температура насыщенного пара при разных давлениях Давление Температура, нормальное, атм кПа °С 1,0 101,32 100 1,5 151,98 111 2,0 202,65 121 2,5 251,20 128 3,0 299,75 134 При этом погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Установлено, что споры большинства микроорганизмов не выдержи6 вают и 5-минутную экспозицию в насыщенном паре при 121 °С.

Стерилизацию текучим паром под давлением осуществляют в автоклавах. Автоклав представляет собой металлический двустенный резервуар, способный выдерживать высокое давление, в который помещают стерилизуемый материал на специальную подставку. Предметы следует размещать не слишком плотно, так как пар должен проходить между ними, иначе они не нагреваются до нужной температуры и могут остаться нестерильными. По окончании времени стерилизации автоклав открывают, когда давление в нем сравняется с атмосферным. Преждевременное открывание крана автоклава недопустимо, так как перегретые среды при резком снижении давления сразу же бурно закипают, смачивают и даже иногда выталкивают ватные пробки, что нарушает впоследствии стерильность материала. К работе с автоклавом допускаются только подготовленные лица! Подготовка сред к стерилизации.

При автоклавировании 3 - 5 % жидкости теряются в результате испарения, поэтому рекомендуется в приготавливаемые среды добавлять сверх объема примерно 5% дистиллированной воды. Тогда после стерилизации среда (раствор) будет иметь требуемую концентрацию. Среды обычно стерилизуют в пробирках, колбах, бутылях.

Емкости заполняют средой не более чем на половину их высоты, чтобы предотвратить смачивание пробок. Сосуды со средами закрывают ватными пробками с бумажными колпачками. Стеклянные, резиновые, корковые и другие пробки завертывают в двойной слой оберточной бумаги и стерилизуют привязанными к склянке, закрытой ватной пробкой. Выбор режима автоклавирования. В микробиологической практике стерилизацию в автоклавах осуществляют при температуре в пределах 111-138 °С, т.е. от 0,5 до 2,5 атм. Температура ниже 111 °С не может считаться надежной; а выше 138 0С, как правило, не является необходимой, к тому же, чем выше давление пара, тем сложнее условия эксплуатации автоклава. Микробиологи чаще всего стерилизуют среды при 0,5 и 1 атм. Температура и длительность автоклавирования питательных сред определяются, прежде всего, их составом, термоустойчивостью или термолабильностью компонентов.

Стерилизация легко разрушающиеся субстраты при 0,5 атм в течение 15-30 мин / Sterilization of easily degraded substrates at 0.5 atm for 15-30 minutes

Мясопептонные среды можно стерилизовать при 1,0 атм 20 мин. С трудом поддаются стерилизации в автоклаве различные порошки (например тальк) и вязкие жидкости (глицерин, вазелиновое масло), поэтому их лучше стерилизовать в сушильных шкафах при 160 °С в течение 2 или 1 ч при 170 °С. В этом случае слой масла или порошка в сосуде не должен превышать 1,5 см. После автоклавирования среды для проверки стерильности выдерживают 2 - 3 сут в термостате при 30 0С. Если в средах обнаруживается рост микроорганизмов, их готовят заново.

Дробная стерилизация (тиндализация) и пастеризация Тиндализация, дробная стерилизация, была предложена в 1877 г. Тиндалем. Она применяется для сред, портящихся под действием температур выше 100 °С. Тиндализацию осуществляют текучим паром а автоклаве с незавинченной крышкой или в аппарате Коха. Среды прогревают несколько раз по 10 - 15 мин. Между прогреваниями среды ставят в термостат при температуре 3 0 0 С н а 8 - 1 2 ч для прорастания жизнеспособных спор. Среды, не выдерживающие нагревания при 100 °С, прогревают более осторожно при 60 - 80 °С через каждые 8 - 1 2 ч 4 - 5 дней подряд. Однократный прогрев материала при температуре ниже 100 0С известен под названием пастеризация. Этот метод, предложенный Пастером, предназначен для уничтожения только бесспоровых форм микроорганизмов. Следовательно, в подавляющем большинстве случаев он не обеспечивает стерильности.

Пастеризацию проводят при 60-80 0С 10 - 30 мин. Этот процесс используют в пищевой промышленности для обработки молока, фруктовых соков, вина, пива и др.

Стерилизация фильтрованием Фильтрованием стерилизуют синтетические среды строго определенного состава, которые содержат легкоразрушающиеся или летучие компоненты - витамины, аминокислоты (цистеин и цистин), белки, углеводы, антибиотики и др. Фильтрование жидкостей осуществляют через мелкопористые материалы, легко адсорбирующие клетки микроорганизмов: асбест, целлюлозу, фарфор, каолин и др.

Стерилизующими фильтрами теоретически считают такие, размер пор которых не превышает 0,20 мкм. Наиболее широкое распространение в микробиологической практике получили мембранные фильтры, которые в зависимости от величины пор применяют для фильтрования и стерилизации. Для стерилизации используют отечественные фильтры фирм «Владипор», «Владисарт» с диаметром пор 0,20 мкм. Плотные диски, изготовленные из смеси асбеста с целлюлозой, называются фильтрами Зейтца. В зависимости от диаметра пор они обозначаются разными индексами.

Стерилизующими являются СФ-3 и СФ-4. Мембранные фильтры стерилизуют автоклавированием при 1 атм 15 мин или длительным кипячением. Стерилизация стеклянной посуды. Основным способом стерилизации стеклянной посуды является обработка ее сухим горячим воздухом при температуре не выше 180 ° в течение 1 - 3 ч (табл. 2). При этом погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Стерилизацию осуществляют в специальных суховоздушных (сухожаровых) стерилизаторах и сушильных шкафах, приспособленных для стерилизации и обеспечивающих автоматическое поддержание необходимой температуры.

Таблица 2 Время, необходимое для стерилизации стеклянной посуды сухим жаром Температура, °С Время, мин 140 180 150 150 160 120 170 60 Посуда перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта и завернута в бумагу для сохранения стерильности после прогревания. После этого еѐ загружают в стерилизатор (или в сушильный шкаф) не слишком плотно, чтобы обеспечить циркуляцию воздуха и равномерный надежный прогрев стерилизуемого материала. По окончании стерилизации шкаф не открывают до тех пор, пока температура в нем не упадет до 80 °С, так как при резком охлаждении иногда нарушается стерильность материала, а сильно нагретое стекло может растрескаться. Стерилизация инструментов и приборов.

Стерилизация прокаливанием в пламени перед использованием, металлические инструменты / Flame sterilization before use, metal tools

На пламени кратковременно обжигают предметные и покровные стекла, стеклянные шпатели и палочки, фарфоровые ступки и пестики, горлышки колб, пробирок, бутылок, а также ватные пробки при посевах культур и разливе сред. В пламени погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Шприцы лучше всего стерилизовать сухим жаром при 160 0С либо в собранном, либо в разобранном виде. В первом случае длительность стерилизации 75, во втором - 60 мин. Собранные шприцы вместе с иглой стерилизуют в пробирке, закрытой ватной пробкой, разобранные заворачивают в бумагу или ткань.

Можно стерилизовать шприцы и в автоклаве при 1 атм в течение 15-20 мин. Автоклавируют их только в разобранном виде, иначе они повреждаются.

Стерилизация газообразными веществами / Sterilization with gaseous substances

Лабораторную аппаратуру, имеющую зеркальное, оптическое и радиоэлектронное оборудование, а также изделия из термолабильных пластмасс, например центрифужные пробирки, стерилизуют газовым методом. Для газовой стерилизации применяются только те соединения, которые обладают спороцидными свойствами. Это оксид этилена, метилбромид, оксид пропилена, формальдегид, глютаральдегид, бета-пропиолактон, озон и др. Газовую стерилизацию проводят в специальных герметически закрывающихся аппаратах.

Стерилизуемые объекты, помещаемые в камеру, упаковывают как при стерилизации в автоклаве или сушильном шкафу. При проведении газовой стерилизации строго соблюдают правила работы с ядовитыми газообразными веществами. Стерилизация облучением Для стерилизации помещений, оборудования, некоторых медицинских принадлежностей, пищевых продуктов используют различные виды излучений: инфракрасное, ультрафиолетовое, рентгеновские лучи, а-, Р- и у-лучи радиоактивных элементов. Чаще других в микробиологической практике используют ультрафиолетовое облучение. Мощность ультрафиолета измеряется в бактах. Доза УФ-излучения, губительная для различных видов микроорганизмов (кроме спор), составляет 5 мкб/см2

Лабораторная работа № 1. Оборудование микробиологической лаборатории и подготовка посуды к стерилизации, микробиология

Цель работы. Ознакомление с правилами работы в микробиологической лаборатории, с особенностями подготовки помещения, оборудования и лабораторной посуды к работе с микроорганизмами.

Материалы и оборудование: термостат, центрифуги, автоклав, сушильный шкаф, фильтры, бактерицидные лампы, пипетки, чашки Петри, шпатели, пробирки, колбы, предметные стекла, пергаментная бумага, вата, марля.

Ход выполнения работы.

Ознакомьтесь с устройством и применением основных приборов и оборудования микробиологической лаборатории.

В соответствии с описанием этого процесса в теоретической части выполните следующие действия, а именно подготовьте к стерилизации:

Методы приготовления препаратов для микроскопии, микробиология

Микроскопия Изучение морфологии и строения клеток микроорганизмов, величина которых измеряется в большинстве случаев микрометрами (1 мкм = = 10 мм =10 м), возможно только с помощью микроскопов, обеспечивающих увеличение исследуемых объектов в сотни (световая микроскопия) и десятки тысяч (электронная микроскопия) раз. Изображение в световом микроскопе формируется вследствие того, что объект и различные элементы его структуры избирательно поглощают свет с различной длиной волны (абсорбционный контраст) или вследствие изменения фазы световой волны при прохождении света через объект (фазовый контраст). Световая микроскопия включает в себя обычную просвечивающую микроскопию (светло- и темнопольную), фазово-контрастную и люминесцентную.
Светлопольная микроскопия. Существуют различные модели учебных и исследовательских световых микроскопов, которые позволяют определить форму клеток микроорганизмов, их размер, подвижность, степень морфологической гетерогенности, а также характерную для микроорганизмов способность к дифференцирующему окрашиванию. Правила пользования микроскопом. Строгое соблюдение правил пользования микроскопом является непременным условием для каждого работающего с ним.

При работе необходимо соблюдать следующую последовательность:

1. Устанавливают микроскоп в рабочее положение, т.е. так, чтобы колонка была обращена в сторону исследователя, а зеркало - в направлении источника света.
2. Ставят под тубус, пользуясь револьвером, объектив малого увеличения. Как правило, предмет рассматривают вначале при малом увеличении.
3. Проверив, открыта ли диафрагма и поднят ли конденсор, вращают, глядя в окуляр, зеркало и устанавливают его так, чтобы поле зрения оказалось хорошо освещенным.
4. Помещают препарат на предметный столик микроскопа так, чтобы рассматриваемый объект оказался над отверстием столика. Препарат закрепляют с помощью клемм.
5. Находят фокусное расстояние, для чего опускают или поднимают тубус с помощью макрометрического винта. Для окончательной фокусировки пользуются микрометрическим винтом.

При смене объектива, дающего малое увеличение, на объектив большего увеличения требуется соблюдение следующих правил:

Рассматривают препарат в микроскоп левым глазом. Правый глаз при этом должен оставаться открытым. Левую руку держат на микрометрическом винте и слегка вращают его (влево и вправо).

Этим достигается возможность рассмотрения поверхностных и более глубоких участков объекта. Правой (свободной) рукой делают зарисовку того, что видно в поле зрения.

Правила работы с иммерсионным объективом. Сухой окрашенный препарат (приготовление см. ниже) помещают на столик микроскопа и, пользуясь объективом 8х, устанавливают свет.

Затем в центр препарата на мазок наносят каплю иммерсионного масла и заменяют сухую систему иммерсионной. С помощью макрометрического винта опускают тубус микроскопа до погружения объектива в масло. Эту операцию нужно проводить очень осторожно, следя сбоку за тем, чтобы фронтальная линза не коснулась предметного стекла и не получила повреждения. После погружения объектива в масло осторожно, также пользуясь макровинтом, поднимают тубус и, наблюдая в окуляр, находят плоскость препарата. Точная фокусировка достигается с помощью микрометрического винта. По окончании микроскопирования поднимают тубус, снимают препарат и осторожно протирают фронтальную линзу объектива сначала сухой хлопчатобумажной салфеткой, а затем той же салфеткой, но слегка смоченной ксилолом. Оставлять масло на поверхности линзы ни в коем случае нельзя, так как оно способствует фиксированию пыли и может со временем привести к повреждению оптики микроскопа. Изучение микроорганизмов в световом микроскопе.

Выбор методов микроскопического анализа и способов окраски определяется конкретной целью исследования.

Препараты готовят, как правило, на предметных стеклах, толщина которых не должна превышать 1,2 - 1,4 мм. Применение более толстых стекол не позволяет получить резкое изображение краев диафрагмы осветителя в плоскости препарата. Поверхность стекла должна быть тщательно очищена и обезжирена, чтобы капля жидкости равномерно расплывалась по стеклу. Это достигается протиранием стекол ватой, смоченной эфиром (после этого промывание водой не требуется), или обжиганием поверхности стекол в пламени горелки (жир при этом сгорает).

Покровные стекла, применяемые для приготовления препаратов микроорганизмов, также должны быть тщательно вымыты и высушены. Толщина покровных стекол не должна превышать 0,15-0,17 мм. Более толстые покровные стекла резко ухудшают качество получаемого изображения. Препараты живых клеток микроорганизмов

1. «Раздавленная капля». На предметное стекло наносят каплю водопроводной воды и помещают в нее небольшое количество клеток изучаемых микроорганизмов, размешивают и накрывают покровным стеклом. Микроорганизмы, выращенные на плотной питательной среде, переносят в каплю воды бактериологической петлей, выращенные в жидкой среде - стерильной пипеткой. В этом случае каплю воды на предметное стекло можно не наносить. Капля исследуемого материала должна быть настолько мала, чтобы после прижимания ее покровным стеклом не было избытка жидкости, выступающего из-под него. В противном случае избыток жид кости необходимо удалить фильтровальной бумагой.

2. «Висячая капля». Каплю суспензии микроорганизмов петлей наносят на покровное стекло, которое поворачивают каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля должна висеть свободно, не касаясь краев и дна лунки. Края лунки предварительно смазывают вазелином. Капля оказывается герметизированной во влажной камере, что делает возможным многодневное наблюдение за объектом. Для длительных наблюдений используют стерильные стекла, а суспензию микроорганизмов готовят на жидкой питательной среде. Препараты фиксированных окрашенных клеток микроорганизмов

Приготовление фиксированных окрашенных препаратов включает следующие этапы: приготовление мазка, высушивание, фиксацию и окраску.

1. Приготовление мазка. На обезжиренное спиртом предметное стекло помещают маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлей небольшое количество исследуемого материала как для препарата «раздавленная капля». Полученную суспензию равномерно размазывают петлей на площади 1 - 2 см2 возможно более тонким слоем. Мазок должен быть настолько тонок, чтобы высыхал после приготовления.
2. Высушивание мазка. Лучше всего сушить готовый препарат при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает быстро. Если высушивание мазка замедлено, то препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить осторожно, не перегревая мазка, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

3. Фиксация препарата преследует несколько целей: убить микроорганизмы, то есть сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; обес печить лучшее прилипание клеток к стеклу; сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые. Самым распространенным способом фиксации является термическая обработка. Для этого препарат трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом происходят грубые изменения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток, например их сморщивание. Для исследования тонкого строения клетки прибегают к фиксации различными химическими веществами. Фиксирующую жидкость наливают на мазок, либо препарат на определенное время погружают в стакан с фиксатором.

4. Окраска. Клетки микроорганизмов окрашивают главным образом анилиновыми красителями. Различают простые и дифференциальные спо собы окрашивания микроорганизмов. При простой окраске прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальная окраска предполагает окрашивание не всей клетки, а опре деленных ее структур. С помощью дифференциальной окраски выявляют некоторые клеточные структуры и запасные вещества. Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым синим. Для получения более чистых препаратов краситель наливают на мазок, покрытый фильтровальной бумагой.

Метод окрашивания в модификации

Синева позволяет использовать вместо растворов красителей фильтровальную бумагу, заранее пропитанную красителем. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки микроорганизмов. Фиксированные, окрашенные препараты могут храниться длительное время. Необходимо помнить, что возраст культуры, состав среды и условия культивирования существенно влияют на морфологию и цитологию микроорганизмов.

Лабораторная работа № 2. Устройство биологического микроскопа, типы микроскопии и правила пользования иммерсионным объективом микроскопа, микробиология

Устройство биологического микроскопа, типы микроскопии и правила пользования иммерсионным объективом микроскопа

Цель работы. Изучить устройство биологического микроскопа, различных типов микроскопии, правила пользования иммерсионным объективом микроскопа.

Материалы и оборудование.

Микроскоп, предметные стекла, покровные стекла, пинцет, бактериологическая петля, спиртовка, спички, карандаш по стеклу, столик для окраски мазков, пипетки объемом 1 и 2 см3 , дистиллированная вода, пергамент, готовые препараты для микроскопии, иммерсионное масло для микроскопии.

Ход выполнения работы.

В соответствии с описанием в теоретической части выполните следующие задания:

Лабораторная работа № 3. Приготовление прижизненных препаратов клеток микроорганизмов, микробиология

Приготовление прижизненных препаратов клеток микроорганизмов

Цель работы. Освоить методы приготовления препаратов живых клеток микроорганизмов для микроскопии.

Материалы и оборудование.

Микроскоп, предметные стекла, покровные стекла, пинцет, бактериологическая петля, спиртовка, спички, карандаш по стеклу, столик для окраски мазков, пипетки объемом 1 и 2 см3 дистиллированная вода, чистая культура микроорганизмов, красители (метиленовый синий, основной фуксин, карболовый фуксин, малахитовый зеленый), готовые препараты для микроскопии.

Ход выполнения работы.

В соответствии с описанием методов приготовления препаратов в теоретической части выполните следующие задания:

Лабораторная работа № 4. Препараты фиксированных окрашенных клеток микроорганизмов, микробиология

Препараты фиксированных окрашенных клеток микроорганизмов Цель работы.

Освоить методы приготовления фиксированных окрашенных клеток микроорганизмов для микроскопии.

Материалы и оборудование

. Микроскоп, предметные стекла, пинцет, бактериологическая петля, спиртовка, спички, карандаш по стеклу, столик для окраски мазков, пипетки объемом 1 и 2 см3 , дистиллированная вода, пергамент, чистая культура микроорганизмов, красители (метиленовый синий, основной фуксин, карболовый фуксин, малахитовый зеленый), иммерсионное масло для микроскопии. Ход выполнения работы.

В соответствии с описанием приготовления фиксированных окрашенных клеток микроорганизмов в теоретической части выполните следующие задания:

1. Приготовьте препарат фиксированных окрашенных клеток бакте рий E.coli.
2. Изучите препарат и зарисуйте его в альбом.

Изучение морфологии и клеточных структур микроорганизмов посредством световой микроскопии, микробиология

Морфология грибов, микробиология

Морфология простейших, микробиология

Лабораторная работа № 5. Морфология бактерий, микробиология

Лабораторная работа № 5 Морфология бактерий

Цель работы

Изучить морфологию различных бактериальных клеток, некоторые методы окраски микроорганизмов.

Материалы и оборудование

Микроскоп, предметные стекла, покровные стекла, пинцет, бактериологическая петля, спиртовка, спички, карандаш по стеклу, столик для окраски мазков, пипетки объемом 1 и 2 см3 , дистиллированная вода, чистые культуры бактерий, красители (кристал21 лвиолет, фуксин Циля, метиленовый синий, основной фуксин, карболовый фуксин, малахитовый зеленый), раствор Люголя, этиловый спирт, готовые препараты бактерий, иммерсионное масло для микроскопии.

Ход выполнения работы

1. Просмотрите готовые препараты фиксированных окрашенных бактерий, изучите их и зарисуйте в альбом.
2. Приготовьте препараты фиксированных окрашенных шаровид ных клеток бактерий (род Micrococcus, Staphilococcus, Streptococcus), изу чите и зарисуйте в альбом.
3. Приготовьте препараты фиксированных окрашенных палочко видных клеток бактерий (Escherichia coli, Bacillus subtilis), изучите и зари суйте в альбом.

Лабораторная работа № 6. Морфология спирохет, микробиология

Лабораторная работа № 6 Морфология спирохет

Цель работы

Изучить морфологию спирохет, выявляемых в препарате из зубного налѐта, окрашенном негативным методом по Бурри.

Материалы и оборудование

Микроскоп, предметные стекла, покровные стекла, пинцет, стерильные палочки, бактериологическая петля, спиртовка, спички, карандаш по стеклу, столик для окраски мазков, пипетки объемом 1 и 2 см3 , дистиллированная вода, черная тушь, этиловый спирт, иммерсионное масло для микроскопии.

Ход выполнения работы

1. Приготовьте мазок из зубного налета, взятого стерильной палоч кой. Нанесите на сухой мазок раствор негативного красителя (жидкая тушь, конго красный), высушите.
2. Можно приготовить препарат вторым способом:
каплю исследуе мой суспензии бактерий смешать с красителем непосредственно на пред метном стекле, накрыть еѐ покровным стеклом.
3. Сухой препарат (или приготовленный вторым способом) рас смотрите под иммерсией.
4. Зарисуйте:
на темном фоне туши видны неокрашенные большая и малая зубные спирохеты - Spirochaeta macrodenta и Spirochaeta microdenta.

Лабораторная работа № 7. Морфология споровых микроорганизмов, микобактерий и актиномицетов, микробиология

Лабораторная работа № 7 Морфология споровых микроорганизмов, микобактерий и актиномицетов

Цель работы

Ознакомиться с морфологией споровых микроорганизмов, микобактерий и актиномицетов.

Материалы и оборудование

Микроскоп, готовые препараты споровых микроорганизмов, микобактерий и актиномицетов, иммерсионное масло для микроскопии.

Ход выполнения работы

1. Просмотрите готовые препараты микроорганизмов с иммерсион ной системой.
2. Зарисуйте каждый препарат в альбом.

Лабораторная работа № 8. Морфология дрожжевых грибов, микробиология

Лабораторная работа № 8 Морфология дрожжевых грибов

Цель работы

Изучить морфологию клеток дрожжевых грибов.

Материалы и оборудование

Микроскоп, предметные стекла, покровные стекла, пинцет, бактериологическая петля, спиртовка, спички, карандаш по стеклу, столик для окраски мазков, пипетки объемом 1 и 2 см3 , дистиллированная вода, чистые культуры дрожжей, красители (кристаллвиолет, фуксин Циля, метиленовый синий, основной фуксин, карболовый фуксин, малахитовый зеленый), раствор Люголя, этиловый спирт, иммерсионное масло для микроскопии.

Ход выполнения работы

1. Приготовьте мазок из чистой культуры дрожжей.
2. Окрасьте фиксированный мазок по Грамму.
3. Полученный препарат рассмотрите под иммерсией.
4. Зарисуйте в альбом.

Морфология клеточных структур, микробиология

Морфология клеточных структур Клеточная стенка. Тонкую структуру клеточной стенки хорошо видно лишь в электронном микроскопе. Для наблюдения клеточной стенки в световом микроскопе применяют метод темного поля либо специальную окраску, с помощью которой удается легко выявить границы между отдельными клетками, расположенными в виде длинных нитей или плотных агрегатов. На обезжиренном стекле делают мазок клеток исследуемых бактерий, высушивают его на воздухе и фиксируют в течение 5 мин 5%-ным раствором фосфоромолибденовой кислоты.

Затем препарат промывают водой и окрашивают не более 15 мин 0,02%-ным раствором кристаллвиолета. Снова промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. Клеточная стенка окрашивается в черный цвет, а цитоплазма - в бледно-сиреневый. Выявление кислотоустойчивости. Кислотоустойчивость - свойство, характерное для некоторых микобактерий и нокардий. Оно заключается в сохранении окраски клетками этих бактерий при обработке их кислотой. Наибольшее распространение получил способ выявления кислотоустойчивости по Циль-Нильсену. На обезжиренном предметном стекле готовят два мазка:

исследуемых клеток и клеток кислотоустойчивых микобактерий. Препарат высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. На мазки помещают фильтровальную бумагу, заливают препарат карболовым фуксином Циля и затем 2 - 3 раза подогревают его до появления паров, держа стекло высоко над пламенем горелки. За появлением паров наблюдают, глядя на мазок сбоку, и при их появлении тотчас отставляют препарат в сторону. После этого препарату дают остыть, снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и мазок промывают водой. Затем препарат обесцвечивают 5%-ным раствором Н2SO

4. Для этого предметное стекло погружают 2 - 3 раза в стакан с кислотой, не задерживая его в ней. Препарат вновь тщательно промывают водой и докрашивают 3-5 мин метиловым синим по Леффлеру. Краску сливают, препарат промывают водой, высушивают и исследуют с иммерсионной системой. При строгом соблюдении режима окраски кислотоустойчивые клетки приобретают красный цвет, тогда как некислотоустойчивые - синий. Нуклеоид. Довольно четко нуклеоид обнаруживается у следующих бактерий:
Proteus vulgaris, Azotobacter chroococcum, Bacillus megaterium, 24 Bacillus mycoides, Bacillus subtilis. На предметном стекле делают мазок суточной культуры бактерий, высушивают его на воздухе и фиксируют в течение 2 - 3 мин в парах осмиевой кислоты. С этой целью на дно чашки Петри наносят 2 - 3 капли фиксатора, а предметное стекло помещают мазком вниз на обрезки стекла. По окончании фиксации препарат опускают на 2 - 3 мин в стаканчик с раствором 1 н. HCl для гидролиза рибосомальной РНК. Стакан держат на водяной бане при 60 °С. После гидролиза препарат немедленно промывают водой. Затем мазок помещают на 15 мин в 1%-ный раствор формалина, вновь промывают водой и окрашивают в течение 1 - 2 мин 0,1 - 1,0%-ным раствором основного фуксина. Препарат промывают, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. Цитоплазма окрашивается в розовый цвет, нуклеоид - в ярко-малиновый. Эндоспоры. Эндоспоры образуют бактерии родов Bacillus, Clostridium и некоторых других. Для обнаружения способности клеток к спорообразованию лучше использовать старые культуры. Споры можно обнаружить при наблюдении живых клеток, а также путем дифференциального окрашивания цитоплазмы и споры. В случае выявления у микроорганизма способности к образованию спор необходимо обратить внимание на тип спорообразования (бациллярный, клостридиальный, плектридиальный), расположение споры в клетке (центральное, эксцентральное или полярное), форму свободных спор (круглая, овальная или продолговатая) и определить их размеры. С этой целью просматривают клетки 2 - 3 - суточной культуры, так как большинство спорообразующих бактерий проходят за этот период времени все стадии развития - от вегетативной клетки до свободной споры. Наблюдение спор в живых клетках. Споры по сравнению с цитоплазмой характеризуются более высоким показателем преломления света, поэтому при микроскопировании в светлом поле они видны как более темные включения округлой или овальной формы. При использовании фазово-контрастного устройства споры имеют вид светлых включений на фоне почти черных клеток. Метод выявления спор негативным окрашиванием.

На предметном стекле готовят тонкий мазок клеток спорулирующих бактерий, подсушивают на воздухе и фиксируют в пламени. Затем на 3 - 5 мин наносят метиленовый синий или на 1 - 3 мин фуксин, после чего препарат осторожно просушивают на воздухе. Просматривают с иммерсией. Вегетативные клетки бактерий прокрашиваются, а споры, имеющие многослойную, труднопроницаемую оболочку - нет. Они видны как сильно преломляющие свет сферические или овальные образования, находящиеся в зависимости от стадии спорообразования внутри или вне клеток бактерий. Метод удобен при количественной оценке процесса спорообразования путем подсчета количества спор и вегетативных клеток в разных условиях роста бактерий. Дифференциальная окраска споры по методу Пешкова. Споры и цитоплазму окрашивают при нагревании. Промывание препарата водой ведет к обесцвечиванию цитоплазмы, тогда как спора прочно удерживает краситель. На обезжиренном предметном стекле готовят мазок, высушивают его на воздухе, фиксируют в пламени горелки и заливают раствором метиленового синего по Леффлеру. Краситель доводят до кипения, держа предметное стекло над пламенем горелки. По мере испарения красителя добавляют новые его порции. Продолжительность окраски, считая с момента закипания красителя, - 10 - 20 с. Затем предметное стекло охлаждают, препарат тщательно промывают водой, после чего клетки в течение 30 с докрашивают 0,5%-ным водным раствором нейтрального красного или сафранина. Краситель сливают, препарат промывают водой и просматривают с иммерсионной системой. При правильном окрашивании клетки имеют красный цвет, а споры - синий. Вместо метиленового синего можно использовать малахитовый зеленый. В этом случае препарат, фиксированный в пламени горелки, заливают на 7 - 10 мин 7,5%-ным раствором малахитового зеленого. Окрашивание проводят с подогревом, помещая препарат над сосудом с кипящей водой или над пламенем горелки. По окончании окраски предметное стекло охлаждают, промывают препарат водой и докрашивают клетки 0,25%-ным водным раствором сафранина в течение 1 - 2 мин.

Споры окрашиваются в зеленый цвет, клетки - в розовый. Окраска капсулы. Эти структуры часто имеют консистенцию геля и плохо видны при микроскопировании живых клеток. Химический состав капсул у разных бактерий неодинаков, поэтому их нельзя выявить какимлибо одним методом окраски. Кроме того, капсулы при окраске легко деформируются, а вещество капсулы слабо связывает краситель, который легко отмывается в процессе обработки препарата. Чаще всего для выявления капсул применяют способ «негативной» окраски (негативного контрастирования) с помощью жидкой туши. Для этого небольшое количество клеток с плотной среды помещают в каплю разбавленного фуксина, смешивают с каплей туши, закрывают покровным стеклом и просматривают с объективом 40 х. На общем темном фоне препарата хорошо видны бесцветные капсулы, окружающие клетки микроорганизмов, окрашенные в розовый цвет. Окраска капсул по методу Гинса. На конец предметного стекла микробиологической петлей наносят каплю черной туши, вносят в нее клетки, хорошо перемешивают и ребром покровного стекла делают мазок по всей поверхности стекла. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют 5 - 1 0 мин смесью Никифорова или 3 мин абсолютным метанолом. Далее мазок окрашивают карболовым фуксином Циля, разбавленным водой в соотношении 1:

3. Время окрашивания - 2 - 3 мин. Препарат промывают водой, высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсионной системой. На темно-сером фоне препарата контрастно выделяются розово-малиновые клетки бактерий, окруженные бесцветными капсулами. Окраска по Граму. Эта окраска является важным диагностическим признаком, она коррелирует со многими другими свойствами бактерий. По способности окрашиваться красителями триметилфенолового ряда все бактерии делятся на две группы:
грамположительные и грамотрицательные. Грамположительные бактерии удерживают комплекс генцианового фиолетового с йодом при обработке препарата спиртом и поэтому окрашиваются в фиолетовый цвет. Грамотрицательные бактерии не обладают такой способностью и обесцвечиваются спиртом. При последующей обработке фуксином или сафранином они приобретают розовую окраску. Окраска по Граму заключается в следующем. На одном обезжиренном стекле делают мазки разных микроорганизмов:
в центре - мазок клеток исследуемой культуры, слева и справа - контрольных культур. Клетки одной контрольной культуры должны быть грамположительными (например Micrococcus luteus или Bacillus cereus), другой - грамотрицательными (например Escherichia coli). Мазки следует готовить тонкими, чтобы клетки равномерно распределялись по поверхности стекла и не образовывали скоплений.

Препарат высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1 - 2 мин карболовым генциановым или кристаллическим фиолетовым. Затем краситель сливают и, не промывая мазок водой, обрабатывают его 1 - 2 мин раствором Люголя до почернения. Сливают раствор Люголя, препарат обесцвечивают 0,1 - 1,0 мин 96%- ным этиловым спиртом, быстро промывают водой и дополнительно окрашивают 1-2 мин водным фуксином. Краситель сливают, препарат промы27 вают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой. При правильном окрашивании грамположительные бактерии имеют синефиолетовый цвет, грамотрицательные - розово-красный. Экспресс-метод определения грам-типа микроорганизмов. Метод основан на разрушении клеток грамотрицательных бактерий в щелочной среде и определении свободной ДНК. Для этого на предметное стекло наносят каплю 3%-ного раствора КОН и 1 петлю 24-часовой исследуемой агаровой культуры, тщательно перемешивают. При тестировании грамотрицательных культур через 5 - 7 с при движении петли вверх образуется слизистый след длиной 1 -2 см; если слизь не образуется, то тестируемая культура грамположительная.

Лабораторная работа № 9. Окраска бактерий по Граму, микробиология

Лабораторная работа № 9 Окраска бактерий по Граму

Цель работы

Ознакомиться с техникой окраски бактерий по Граму.

Материалы и оборудование

Микроскоп, предметные стекла, бактериологическая петля, спиртовка, чистые предметные стекла, столик для окрашивания препаратов, промывалка с водой, красящая бумага с кристаллвиолетом или 1%-ный раствор кристаллвиолета или генцианвиолета, раствор Люголя, 96%-ный этанол, 0,1%-ный раствор фуксина или раствор Пфейфера, чистые культуры контрольных (с известным типом окраски) грамположительных и грамотрицательных бактерий и исследуемые микроорганизмы, иммерсионное масло для микроскопии.

Ход выполнения работы

1. Приготовьте на одном предметном стекле три фиксированных мазка бактерий:
а) контрольной грамотрицательной культуры с одного конца стекла; б) контрольной грамположительной культуры с другого кон ца стекла и в) исследуемой культуры в центре стекла. Мазки должны быть тонкими, клетки бактерий должны быть равномерно распределены на стекле, иначе окрашивание будет неправильным.
2. Мазки окрашивают кристаллвиолетом в течение 2 мин.
3. Кристаллвиолет смывают раствором Люголя и заливают мазки этим же раствором на 2 мин.
4. Раствор Люголя смывают и окрашенные мазки обесцвечивают 96%-ным этиловым спиртом, погружая стекло с мазками в стакан со спир том на 30 с или промывая стекло спиртом из пипетки в течение 30 с.
5. Тщательно промывают стекло с мазками водой (предпочтительно дистиллированной) и наносят на стекло 0,1%-ный раствор фуксина или раствор Пфейфера.
6. Через 2 мин краску сливают, стекло тщательно промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют, пользуясь им мерсионным объективом. Грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в красный или розовый цвет дополнительного красителя (фуксина).
7. Зарисуйте каждый препарат в альбом.

Лабораторная работа № 10. Экспресс-метод определения грам-типа микроорганизмов, микробиология

лабораторная работа № 10 Экспресс-метод определения грам-типа микроорганизмов

Цель работы.

Ознакомиться с техникой определения грам-типа микроорганизмов.

Материалы и оборудование

. Микроскоп, предметные стекла, бактериологическая петля, спиртовка, чистые предметные стекла, чистые культуры контрольных (с известным типом окраски) грамположительных и грамотрицательных бактерий и исследуемые микроорганизмы, раствор 3%-ного КОН.

Ход выполнения работы

1. На одно предметное стекло нанесите две капли раствора 3%-ного КОН. В первую каплю внесите бактериологической петлей контрольную грамположительную культуру, а во вторую - грамотрицательную кон трольную культуру.
2. Тщательно перемешайте грамположительную культуру в первой капле с раствором КОН, через 5 - 10 с медленно приподнимите бактерио логическую петлю и убедитесь, что вязкость капли не изменилась, то есть слизь не образуется и реакция отрицательная.
3. Тщательно перемешайте грамотрицательную культуру во второй капле с раствором КОН и через 5 - 10 с медленно приподнимите бактерио логическую петлю на высоту 2 - 3 см. Образовавшаяся слизь свидетельст вует о том, что КОН разрушает бактериальную клеточную стенку и ДНК 29 остается свободной (слизистое образование), т.е. проба положительная, а культура является грамотрицательной.
4. Определите экспресс-методом грам-тип культур, предложенных преподавателем.

Лабораторная работа №11. Окраска капсул бактерий по методу Гинса, микробиология

Лабораторная работа № 12. Окраска спор бактерий, микробиология

Лабораторная работа № 12 Окраска спор бактерий Цель работы. Освоить метод окраски спор бактерий. Материалы и оборудование. Микроскоп, предметные стекла, бактериологические петли, спиртовка, столик для окрашивания препаратов, промывалка с водой, 0,5%-ный водный раствор сафранина, раствор метиленового синего по Леффлеру или малахитовый зеленый, дистиллированная вода, чистые культуры спорообразующих бактерий (Bacillus subtilis, 30 Bacillus cereus), готовые препараты споровых форм бактерий, иммерсионное масло для микроскопии. Ход выполнения работы
1. Приготовьте фиксированный мазок чистой культуры спорообразующих бактерий.
2. Налейте на предметное стекло с мазком один из красителей:
рас твор метиленового синего по Леффлеру или малахитового зеленого.
3. Зажгите спиртовку и, держа стекло пинцетом над пламенем го релки, доведите краситель до кипения. По мере испарения красителя до бавляйте новые его порции. Продолжительность окраски трехкратная по 10-15 с.
4. Затем стекло охладите, препарат тщательно промойте водой и на несите на мазок 0,5%-ный водный раствор сафранина и в течение 30 с до красьте препарат.
5. Снова препарат промойте водой и высушите фильтровальной бу магой.
6. Просмотрите с иммерсионной системой готовый препарат споро вой культуры, представленный преподавателем.
7. Просмотрите с иммерсионной системой препарат споровой куль туры, полученный Вами.
8. Все препараты зарисуйте в альбом. При правильном окрашивании вегетативные клетки окрашиваются в красный цвет, а споры в синий (при окрашивании раствором метиленового синего по Леффлеру) или в зеленый (при окрашивании раствором малахитового зеленого).

Контрольные вопросы Изучение морфологии и клеточных структур микроорганизмов посредством световой микроскопии, микробиология

Изучение морфологии и клеточных структур микроорганизмов посредством световой микроскопии, микробиология контрольные вопросы

1. Что такое капсула, каковы ее химический состав, морфология и функции?
2. Методы окраски бактериальных капсул.
3. Методы окраски клеточной стенки.
4. Окраска бактерий по Граму.
5. Окраска бактерий для определения их кислотоустойчивости.
6. Методы окраски нуклеоида у бактерий.
7. Спорообразование у бактерий, строение спор, расположение в клетке и их функции.
8. Окраска спор.

Культивирование и хранение микроорганизмов. Выделение чистых культур микроорганизмов, микробиология

Основные компоненты питательных сре: Дифференциально-диагностические (индикаторные) среды; Условия культивирования микроорганизмов; Культивирование аэробных микроорганизмов; Культивирование анаэробных микроорганизмов; Вирусология; Лабораторная работа № 14. Получение накопительной и чистой культур бактерий; Лабораторная работа № 15. Культивирование анаэробных культур бактерий; Лабораторная работа № 16. Рост микроорганизмов в периодической культуре; Контрольные вопросы основные компоненты питательных сред;

одноклеточные организмы микробиология

• 03 января 2009

одноклеточные организмы микробиология Парафилетическая группа живых организмов, тело которых состоит из одной клетки (в противоположность многоклеточным). Среди одноклеточных есть и прокариоты, и эукариоты. К ним относятся все археи, бактер...

список лабораторных работ по микробиологии

• 02 января 2009
• микробиология иммунология бактерия возбудитель вирусология эпидемиология

список лабораторных работ по микробиологии

Предмет, задачи изучения науки микробиология, медицинская микробиология

• 02 января 2009
• микробиология вирус генетика

Предмет, задачи изучения науки микробиология, медицинская микробиология На вопрос, что изучает микробиология, можно ответить так: она изучает внешнее многообразие бактерий по форме и размерам, их влияние на окружающую среду и на живые орг...

Общая микробиология

• 01 января 2009
• биохимия микробиология иммунология бактерия возбудитель вирусология эпидемиология

Методы микроскопирования, посев и пересев (получению чистых культур) микроорганизмов

Освоение методов микроскопирования, посевов и пересевов (получению чистых культур) микроорганизмов, культивирования микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах, определения их количества в пробах из объектов окружающей среды, идентификации микроорганизмов по биохимическим свойствам.

Будет рассмотрено лабораторных работ по основным разделам общей микробиологии и построен в соответствии с действующей программой по этому предмету.

Перед каждой работой помещен перечень оборудования и материалов, необходимых для ее проведения.

После каждого раздела рассматриваются контрольные вопросы, а в конце работы - тесты для проверки усвоения материала.

В качестве объектов исследования при выполнении работ предлагается использовать культуры микроорганизмов, широко распространенных в окружающей среде, которые участвуют в биогеохимических превращениях веществ в природе и используются в биотехнологических процессах.

Морфология микроорганизмов, культуральные, физиологические и биохимические свойства,методы микробиологического исследования

Практикум не повторяет работы в изданных ранее учебных пособиях по микробиологии, а содержит задания, позволяющие приобрести навыки работы с микроорганизмами, изучить их морфологию, культуральные, физиологические и биохимические свойства, освоить методы микробиологического исследования объектов окружающей среды.

Представлены некоторые работы, выходящие за пределы программы, которые могут быть использованы в исследованиях, а также при проведении занятий по программам:

список лабораторных работ по микробиологии

Необходимо помнить, что при посеве сапрофитных микроорганизмов из окружающей среды случайно может быть внесена и патогенная микрофлора. Работа с сапрофитными бактериями в ряде случаев требует абсолютной стерильности для получения надежных результатов опыта. В микробиологической практике используют главным образом чистые культуры микроорганизмов. Культуру, содержащую микроорганизмы одного вида, называют чистой. Если в культуре содержится более одного вида микроорганизмов, она носит название смешанной.

Микробиологическая лаборатория включает ряд помещений, где проводят работу с микроорганизмами или подготовку к ней. Поверхность столов и пол всех лабораторных помещений покрывают легко моющимся материалом. В основном рабочем помещении находятся аппаратура, посуда и реактивы. Столы имеют подводку электроэнергии и снабжены газовыми горелками.

Стерилизационная: автоклавы, сушильные шкафы, термостаты, холодильная комната

Кроме основного рабочего помещения лаборатория имеет стерилизационную, где размещено лабораторное оборудование и приборы автоклавы и сушильные шкафы, бокс, моечную, холодильную комнату, термостаты или термостатированные комнаты для выращивания микроорганизмов, помещение для хранения культур и т.д.

Подготовка микробиологической лаборатории к работе Для того чтобы снизить количество микроорганизмов в воздухе и на различных поверхностях, в лабораторных помещениях применяют различные способы дезинфекции. Слово «дезинфекция» означает обеззараживание, то есть уничтожение возбудителей инфекционных болезней на объектах внешней среды.

Помешение микробиологической лаборатории

Пол, стены и мебель в микробиологической лаборатории протирают растворами различных дезинфицирующих веществ

Для проведения дезинфекции помешения можно применять готовые растворы или приготовить самим. Следующие пропорции

Воздух дезинфицировать проветриванием

Воздух в лаборатории наиболее просто дезинфицировать проветриванием. Продолжительная вентиляция помещения через форточку (не менее 30-60 мин) приводит к резкому снижению количества микроорганизмов в воздухе, особенно при значительной разнице в температуре между наружным воздухом и воздухом помещения. Более эффективный и наиболее часто применяемый способ дезинфекции воздуха - облучение ультрафиолетовыми лучами с длиной волны от 200 до 400 нм. Ультрафиолетовые лучи обладают слабой проникающей способностью, поэтому в зависимости от степени загрязненности воздуха для его стерилизации требуется облучение от 30 мин до нескольких часов.

Бактерицидная лампа и ультрафиолетовые лучи

Необходимо иметь в виду, что ультрафиолетовые лучи могут вызвать тяжелые поражения глаз. Поэтому при работе с бактерицидными лампами нужно строго следить за тем, чтобы ни прямые, ни отраженные ультрафиолетовые лучи не попадали в глаза.

Рабочее место, где непосредственно проводится работа с культурами микроорганизмов, требует особенно тщательной обработки.

Рабочий стол следует дезинфицировать не только до начала работы, но и после ее окончания. Для протирания поверхности стола можно использовать растворы лизола и хлорамина, а также 70%-ные (по объему) растворы изопропилового или этилового спиртов.

В лаборатории не разрешается курить, хранить и употреблять еду, напитки, жевательную резинку.

Рабочим специалистам и лаборантам необходимо работать в халатах.

Правила работы с культурами микроорганизмов

В лаборатории микроорганизмы выращивают в питательных средах, которые разливают в пробирки, колбы, матрацы и чашки Петри.

Посев или инокуляцией внесение микроорганизмов

Внесение микроорганизмов в стерильную среду называется посевом, или инокуляцией. Перед посевом следует тщательно надписать на пробирке (колбе или чашке Петри) название микроорганизма и дату посева. Надпись делают маркером на стекле или на наклеенной этикетке. Клетки микроорганизмов для посева или приготовления препаратов берут бактериологической петлей, если микроорганизмы выращены на плотной среде.

В том случае, когда пересевают культуры микроорганизмов, выросшие в жидкой питательной среде, пользуются стерильной пипеткой. Использованную пипетку следует немедленно перенести в дезинфицирующий раствор, например 3 - 5%-ный водный раствор фенола или 2%-ный раствор хлорамина, не касаясь ею окружающих предметов.

Все манипуляции при посеве следует проводить около пламени горелки (но не в пламени).

Методы стерилизации питательных сред и посуды, микробиология / Methods of sterilization of nutrient media and dishes, microbiology

Стерилизация является одним из важнейших и необходимых приемов в микробиологической практике. Слово «стерилизация» в переводе с латинского означает обеспложивание. В практической работе под стерилизацией понимают методы, применяемые для уничтожения всех форм жизни как на поверхности, так и внутри стерилизуемых объектов. Различают термическую и холодную стерилизацию. Способы термической стерилизации: прокаливание в пламени и обжигание, сухожаровая стерилизация (горячим воздухом), стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование), дробная стерилизация (тиндализация), кипячение. Методы холодной стерилизации: стерилизация фильтрованием, газообразными средствами, ультрафиолетовыми лучами и другими видами излучений.

Физико-химические свойства материала и стерилизация / Physical and chemical properties of the material and sterilization

Возможность и целесообразность применения того или иного способа определяется в первую очередь физико-химическими свойствами материала, подлежащего стерилизации, а иногда и целью исследования.

Стерилизация питательных сред насыщенным паром под давлением (автоклавирование) Совместное действие высокой температуры и давления пара обеспечивает особую эффективность данного способа (табл. 1).

Таблица 1

Температура насыщенного пара при разных давлениях Давление Температура, нормальное, атм кПа °С 1,0 101,32 100 1,5 151,98 111 2,0 202,65 121 2,5 251,20 128 3,0 299,75 134 При этом погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Установлено, что споры большинства микроорганизмов не выдержи6 вают и 5-минутную экспозицию в насыщенном паре при 121 °С.

Стерилизацию текучим паром под давлением осуществляют в автоклавах. Автоклав представляет собой металлический двустенный резервуар, способный выдерживать высокое давление, в который помещают стерилизуемый материал на специальную подставку. Предметы следует размещать не слишком плотно, так как пар должен проходить между ними, иначе они не нагреваются до нужной температуры и могут остаться нестерильными. По окончании времени стерилизации автоклав открывают, когда давление в нем сравняется с атмосферным. Преждевременное открывание крана автоклава недопустимо, так как перегретые среды при резком снижении давления сразу же бурно закипают, смачивают и даже иногда выталкивают ватные пробки, что нарушает впоследствии стерильность материала. К работе с автоклавом допускаются только подготовленные лица! Подготовка сред к стерилизации.

При автоклавировании 3 - 5 % жидкости теряются в результате испарения, поэтому рекомендуется в приготавливаемые среды добавлять сверх объема примерно 5% дистиллированной воды. Тогда после стерилизации среда (раствор) будет иметь требуемую концентрацию. Среды обычно стерилизуют в пробирках, колбах, бутылях.

Емкости заполняют средой не более чем на половину их высоты, чтобы предотвратить смачивание пробок. Сосуды со средами закрывают ватными пробками с бумажными колпачками. Стеклянные, резиновые, корковые и другие пробки завертывают в двойной слой оберточной бумаги и стерилизуют привязанными к склянке, закрытой ватной пробкой. Выбор режима автоклавирования. В микробиологической практике стерилизацию в автоклавах осуществляют при температуре в пределах 111-138 °С, т.е. от 0,5 до 2,5 атм. Температура ниже 111 °С не может считаться надежной; а выше 138 0С, как правило, не является необходимой, к тому же, чем выше давление пара, тем сложнее условия эксплуатации автоклава. Микробиологи чаще всего стерилизуют среды при 0,5 и 1 атм. Температура и длительность автоклавирования питательных сред определяются, прежде всего, их составом, термоустойчивостью или термолабильностью компонентов.

Стерилизация легко разрушающиеся субстраты при 0,5 атм в течение 15-30 мин / Sterilization of easily degraded substrates at 0.5 atm for 15-30 minutes

Мясопептонные среды можно стерилизовать при 1,0 атм 20 мин. С трудом поддаются стерилизации в автоклаве различные порошки (например тальк) и вязкие жидкости (глицерин, вазелиновое масло), поэтому их лучше стерилизовать в сушильных шкафах при 160 °С в течение 2 или 1 ч при 170 °С. В этом случае слой масла или порошка в сосуде не должен превышать 1,5 см. После автоклавирования среды для проверки стерильности выдерживают 2 - 3 сут в термостате при 30 0С. Если в средах обнаруживается рост микроорганизмов, их готовят заново.

Дробная стерилизация (тиндализация) и пастеризация Тиндализация, дробная стерилизация, была предложена в 1877 г. Тиндалем. Она применяется для сред, портящихся под действием температур выше 100 °С. Тиндализацию осуществляют текучим паром а автоклаве с незавинченной крышкой или в аппарате Коха. Среды прогревают несколько раз по 10 - 15 мин. Между прогреваниями среды ставят в термостат при температуре 3 0 0 С н а 8 - 1 2 ч для прорастания жизнеспособных спор. Среды, не выдерживающие нагревания при 100 °С, прогревают более осторожно при 60 - 80 °С через каждые 8 - 1 2 ч 4 - 5 дней подряд. Однократный прогрев материала при температуре ниже 100 0С известен под названием пастеризация. Этот метод, предложенный Пастером, предназначен для уничтожения только бесспоровых форм микроорганизмов. Следовательно, в подавляющем большинстве случаев он не обеспечивает стерильности.

Пастеризацию проводят при 60-80 0С 10 - 30 мин. Этот процесс используют в пищевой промышленности для обработки молока, фруктовых соков, вина, пива и др.

Стерилизация фильтрованием Фильтрованием стерилизуют синтетические среды строго определенного состава, которые содержат легкоразрушающиеся или летучие компоненты - витамины, аминокислоты (цистеин и цистин), белки, углеводы, антибиотики и др. Фильтрование жидкостей осуществляют через мелкопористые материалы, легко адсорбирующие клетки микроорганизмов: асбест, целлюлозу, фарфор, каолин и др.

Стерилизующими фильтрами теоретически считают такие, размер пор которых не превышает 0,20 мкм. Наиболее широкое распространение в микробиологической практике получили мембранные фильтры, которые в зависимости от величины пор применяют для фильтрования и стерилизации. Для стерилизации используют отечественные фильтры фирм «Владипор», «Владисарт» с диаметром пор 0,20 мкм. Плотные диски, изготовленные из смеси асбеста с целлюлозой, называются фильтрами Зейтца. В зависимости от диаметра пор они обозначаются разными индексами.

Стерилизующими являются СФ-3 и СФ-4. Мембранные фильтры стерилизуют автоклавированием при 1 атм 15 мин или длительным кипячением. Стерилизация стеклянной посуды. Основным способом стерилизации стеклянной посуды является обработка ее сухим горячим воздухом при температуре не выше 180 ° в течение 1 - 3 ч (табл. 2). При этом погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Стерилизацию осуществляют в специальных суховоздушных (сухожаровых) стерилизаторах и сушильных шкафах, приспособленных для стерилизации и обеспечивающих автоматическое поддержание необходимой температуры.

Таблица 2 Время, необходимое для стерилизации стеклянной посуды сухим жаром Температура, °С Время, мин 140 180 150 150 160 120 170 60 Посуда перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта и завернута в бумагу для сохранения стерильности после прогревания. После этого еѐ загружают в стерилизатор (или в сушильный шкаф) не слишком плотно, чтобы обеспечить циркуляцию воздуха и равномерный надежный прогрев стерилизуемого материала. По окончании стерилизации шкаф не открывают до тех пор, пока температура в нем не упадет до 80 °С, так как при резком охлаждении иногда нарушается стерильность материала, а сильно нагретое стекло может растрескаться. Стерилизация инструментов и приборов.

Стерилизация прокаливанием в пламени перед использованием, металлические инструменты / Flame sterilization before use, metal tools

На пламени кратковременно обжигают предметные и покровные стекла, стеклянные шпатели и палочки, фарфоровые ступки и пестики, горлышки колб, пробирок, бутылок, а также ватные пробки при посевах культур и разливе сред. В пламени погибают и вегетативные клетки, и споры микроорганизмов. Шприцы лучше всего стерилизовать сухим жаром при 160 0С либо в собранном, либо в разобранном виде. В первом случае длительность стерилизации 75, во втором - 60 мин. Собранные шприцы вместе с иглой стерилизуют в пробирке, закрытой ватной пробкой, разобранные заворачивают в бумагу или ткань.

Можно стерилизовать шприцы и в автоклаве при 1 атм в течение 15-20 мин. Автоклавируют их только в разобранном виде, иначе они повреждаются.

Стерилизация газообразными веществами / Sterilization with gaseous substances

Лабораторную аппаратуру, имеющую зеркальное, оптическое и радиоэлектронное оборудование, а также изделия из термолабильных пластмасс, например центрифужные пробирки, стерилизуют газовым методом. Для газовой стерилизации применяются только те соединения, которые обладают спороцидными свойствами. Это оксид этилена, метилбромид, оксид пропилена, формальдегид, глютаральдегид, бета-пропиолактон, озон и др. Газовую стерилизацию проводят в специальных герметически закрывающихся аппаратах.

Стерилизуемые объекты, помещаемые в камеру, упаковывают как при стерилизации в автоклаве или сушильном шкафу. При проведении газовой стерилизации строго соблюдают правила работы с ядовитыми газообразными веществами. Стерилизация облучением Для стерилизации помещений, оборудования, некоторых медицинских принадлежностей, пищевых продуктов используют различные виды излучений: инфракрасное, ультрафиолетовое, рентгеновские лучи, а-, Р- и у-лучи радиоактивных элементов. Чаще других в микробиологической практике используют ультрафиолетовое облучение. Мощность ультрафиолета измеряется в бактах. Доза УФ-излучения, губительная для различных видов микроорганизмов (кроме спор), составляет 5 мкб/см2

Лабораторная работа № 1. Оборудование микробиологической лаборатории и подготовка посуды к стерилизации, микробиология

Цель работы. Ознакомление с правилами работы в микробиологической лаборатории, с особенностями подготовки помещения, оборудования и лабораторной посуды к работе с микроорганизмами.

Материалы и оборудование: термостат, центрифуги, автоклав, сушильный шкаф, фильтры, бактерицидные лампы, пипетки, чашки Петри, шпатели, пробирки, колбы, предметные стекла, пергаментная бумага, вата, марля.

Ход выполнения работы.

Ознакомьтесь с устройством и применением основных приборов и оборудования микробиологической лаборатории.

В соответствии с описанием этого процесса в теоретической части выполните следующие действия, а именно подготовьте к стерилизации:

Методы приготовления препаратов для микроскопии, микробиология

Микроскопия Изучение морфологии и строения клеток микроорганизмов, величина которых измеряется в большинстве случаев микрометрами (1 мкм = = 10 мм =10 м), возможно только с помощью микроскопов, обеспечивающих увеличение исследуемых объектов в сотни (световая микроскопия) и десятки тысяч (электронная микроскопия) раз. Изображение в световом микроскопе формируется вследствие того, что объект и различные элементы его структуры избирательно поглощают свет с различной длиной волны (абсорбционный контраст) или вследствие изменения фазы световой волны при прохождении света через объект (фазовый контраст). Световая микроскопия включает в себя обычную просвечивающую микроскопию (светло- и темнопольную), фазово-контрастную и люминесцентную.
Светлопольная микроскопия. Существуют различные модели учебных и исследовательских световых микроскопов, которые позволяют определить форму клеток микроорганизмов, их размер, подвижность, степень морфологической гетерогенности, а также характерную для микроорганизмов способность к дифференцирующему окрашиванию. Правила пользования микроскопом. Строгое соблюдение правил пользования микроскопом является непременным условием для каждого работающего с ним.

При работе необходимо соблюдать следующую последовательность:

1. Устанавливают микроскоп в рабочее положение, т.е. так, чтобы колонка была обращена в сторону исследователя, а зеркало - в направлении источника света.
2. Ставят под тубус, пользуясь револьвером, объектив малого увеличения. Как правило, предмет рассматривают вначале при малом увеличении.
3. Проверив, открыта ли диафрагма и поднят ли конденсор, вращают, глядя в окуляр, зеркало и устанавливают его так, чтобы поле зрения оказалось хорошо освещенным.
4. Помещают препарат на предметный столик микроскопа так, чтобы рассматриваемый объект оказался над отверстием столика. Препарат закрепляют с помощью клемм.
5. Находят фокусное расстояние, для чего опускают или поднимают тубус с помощью макрометрического винта. Для окончательной фокусировки пользуются микрометрическим винтом.

При смене объектива, дающего малое увеличение, на объектив большего увеличения требуется соблюдение следующих правил:

Рассматривают препарат в микроскоп левым глазом. Правый глаз при этом должен оставаться открытым. Левую руку держат на микрометрическом винте и слегка вращают его (влево и вправо).

Этим достигается возможность рассмотрения поверхностных и более глубоких участков объекта. Правой (свободной) рукой делают зарисовку того, что видно в поле зрения.

Правила работы с иммерсионным объективом. Сухой окрашенный препарат (приготовление см. ниже) помещают на столик микроскопа и, пользуясь объективом 8х, устанавливают свет.

Затем в центр препарата на мазок наносят каплю иммерсионного масла и заменяют сухую систему иммерсионной. С помощью макрометрического винта опускают тубус микроскопа до погружения объектива в масло. Эту операцию нужно проводить очень осторожно, следя сбоку за тем, чтобы фронтальная линза не коснулась предметного стекла и не получила повреждения. После погружения объектива в масло осторожно, также пользуясь макровинтом, поднимают тубус и, наблюдая в окуляр, находят плоскость препарата. Точная фокусировка достигается с помощью микрометрического винта. По окончании микроскопирования поднимают тубус, снимают препарат и осторожно протирают фронтальную линзу объектива сначала сухой хлопчатобумажной салфеткой, а затем той же салфеткой, но слегка смоченной ксилолом. Оставлять масло на поверхности линзы ни в коем случае нельзя, так как оно способствует фиксированию пыли и может со временем привести к повреждению оптики микроскопа. Изучение микроорганизмов в световом микроскопе.

Выбор методов микроскопического анализа и способов окраски определяется конкретной целью исследования.

Препараты готовят, как правило, на предметных стеклах, толщина которых не должна превышать 1,2 - 1,4 мм. Применение более толстых стекол не позволяет получить резкое изображение краев диафрагмы осветителя в плоскости препарата. Поверхность стекла должна быть тщательно очищена и обезжирена, чтобы капля жидкости равномерно расплывалась по стеклу. Это достигается протиранием стекол ватой, смоченной эфиром (после этого промывание водой не требуется), или обжиганием поверхности стекол в пламени горелки (жир при этом сгорает).

Покровные стекла, применяемые для приготовления препаратов микроорганизмов, также должны быть тщательно вымыты и высушены. Толщина покровных стекол не должна превышать 0,15-0,17 мм. Более толстые покровные стекла резко ухудшают качество получаемого изображения. Препараты живых клеток микроорганизмов

1. «Раздавленная капля». На предметное стекло наносят каплю водопроводной воды и помещают в нее небольшое количество клеток изучаемых микроорганизмов, размешивают и накрывают покровным стеклом. Микроорганизмы, выращенные на плотной питательной среде, переносят в каплю воды бактериологической петлей, выращенные в жидкой среде - стерильной пипеткой. В этом случае каплю воды на предметное стекло можно не наносить. Капля исследуемого материала должна быть настолько мала, чтобы после прижимания ее покровным стеклом не было избытка жидкости, выступающего из-под него. В противном случае избыток жид кости необходимо удалить фильтровальной бумагой.

2. «Висячая капля». Каплю суспензии микроорганизмов петлей наносят на покровное стекло, которое поворачивают каплей вниз и помещают на специальное предметное стекло с углублением (лункой) в центре. Капля должна висеть свободно, не касаясь краев и дна лунки. Края лунки предварительно смазывают вазелином. Капля оказывается герметизированной во влажной камере, что делает возможным многодневное наблюдение за объектом. Для длительных наблюдений используют стерильные стекла, а суспензию микроорганизмов готовят на жидкой питательной среде. Препараты фиксированных окрашенных клеток микроорганизмов

Приготовление фиксированных окрашенных препаратов включает следующие этапы: приготовление мазка, высушивание, фиксацию и окраску.

1. Приготовление мазка. На обезжиренное спиртом предметное стекло помещают маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлей небольшое количество исследуемого материала как для препарата «раздавленная капля». Полученную суспензию равномерно размазывают петлей на площади 1 - 2 см2 возможно более тонким слоем. Мазок должен быть настолько тонок, чтобы высыхал после приготовления.
2. Высушивание мазка. Лучше всего сушить готовый препарат при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает быстро. Если высушивание мазка замедлено, то препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить осторожно, не перегревая мазка, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

3. Фиксация препарата преследует несколько целей: убить микроорганизмы, то есть сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; обес печить лучшее прилипание клеток к стеклу; сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые. Самым распространенным способом фиксации является термическая обработка. Для этого препарат трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом происходят грубые изменения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток, например их сморщивание. Для исследования тонкого строения клетки прибегают к фиксации различными химическими веществами. Фиксирующую жидкость наливают на мазок, либо препарат на определенное время погружают в стакан с фиксатором.

4. Окраска. Клетки микроорганизмов окрашивают главным образом анилиновыми красителями. Различают простые и дифференциальные спо собы окрашивания микроорганизмов. При простой окраске прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальная окраска предполагает окрашивание не всей клетки, а опре деленных ее структур. С помощью дифференциальной окраски выявляют некоторые клеточные структуры и запасные вещества. Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым синим. Для получения более чистых препаратов краситель наливают на мазок, покрытый фильтровальной бумагой.

Метод окрашивания в модификации

Синева позволяет использовать вместо растворов красителей фильтровальную бумагу, заранее пропитанную красителем. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки микроорганизмов. Фиксированные, окрашенные препараты могут храниться длительное время. Необходимо помнить, что возраст культуры, состав среды и условия культивирования существенно влияют на морфологию и цитологию микроорганизмов.

Лабораторная работа № 2. Устройство биологического микроскопа, типы микроскопии и правила пользования иммерсионным объективом микроскопа, микробиология

Устройство биологического микроскопа, типы микроскопии и правила пользования иммерсионным объективом микроскопа

Цель работы. Изучить устройство биологического микроскопа, различных типов микроскопии, правила пользования иммерсионным объективом микроскопа.

Материалы и оборудование.

Микроскоп, предметные стекла, покровные стекла, пинцет, бактериологическая петля, спиртовка, спички, карандаш по стеклу, столик для окраски мазков, пипетки объемом 1 и 2 см3 , дистиллированная вода, пергамент, готовые препараты для микроскопии, иммерсионное масло для микроскопии.

Ход выполнения работы.

В соответствии с описанием в теоретической части выполните следующие задания:

Лабораторная работа № 3. Приготовление прижизненных препаратов клеток микроорганизмов, микробиология

Приготовление прижизненных препаратов клеток микроорганизмов

Цель работы. Освоить методы приготовления препаратов живых клеток микроорганизмов для микроскопии.

Материалы и оборудование.

Микроскоп, предметные стекла, покровные стекла, пинцет, бактериологическая петля, спиртовка, спички, карандаш по стеклу, столик для окраски мазков, пипетки объемом 1 и 2 см3 дистиллированная вода, чистая культура микроорганизмов, красители (метиленовый синий, основной фуксин, карболовый фуксин, малахитовый зеленый), готовые препараты для микроскопии.

Ход выполнения работы.

В соответствии с описанием методов приготовления препаратов в теоретической части выполните следующие задания:

Лабораторная работа № 4. Препараты фиксированных окрашенных клеток микроорганизмов, микробиология

Препараты фиксированных окрашенных клеток микроорганизмов Цель работы.

Освоить методы приготовления фиксированных окрашенных клеток микроорганизмов для микроскопии.

Материалы и оборудование

. Микроскоп, предметные стекла, пинцет, бактериологическая петля, спиртовка, спички, карандаш по стеклу, столик для окраски мазков, пипетки объемом 1 и 2 см3 , дистиллированная вода, пергамент, чистая культура микроорганизмов, красители (метиленовый синий, основной фуксин, карболовый фуксин, малахитовый зеленый), иммерсионное масло для микроскопии. Ход выполнения работы.

В соответствии с описанием приготовления фиксированных окрашенных клеток микроорганизмов в теоретической части выполните следующие задания:

1. Приготовьте препарат фиксированных окрашенных клеток бакте рий E.coli.
2. Изучите препарат и зарисуйте его в альбом.

Что такое микробиология, микробиологическая наука

• 01 января 2009
• микробиология гигиена экология инфекция

Что такое микробиология, введение

Рассмотрим достаточно обшиное понятие микробиология - Microbiology. Области исследования науки, что изучает микробиология (структура и функционирование микрорганизмов). Основы микробиологии, сферы применения.

Н  Огромное количество различных подразделов и дочерних наук.  включает в себя наука биология (изучающие все разнообразие живых существах, взаимодействик со средой обитания. Структуру, функционирование, рост, происхождение, эволюцию и распределение живых организмов на Земле. Классифицирует и описывает живые существа, происхождение их видов, взаимодействие между собой и с окружающей средой.)

Однако одной из самых молодых и перспективных, полезных для человека и его деятельности является микробиология. Молодая наука, имеющия активное развитие, стала родоначальницей разделов, как биотехнология и генная инженерия.

Что такое наука микробиология и как проходили этапы ее становления и развития?

Стоит отметить что микробиология превратилась в настоящую науку с  широким спектром областей применения.

Этимология микробиологии

Объемная, интересная, молодая, но динамично развивающаяся наука. Этимология слова ведет свое происхождение от греческого языка.

"mikros" означает "малый", вторая часть слова происходит от "bios", что значит "жизнь", и заключительная часть от греч. "logos", что переводится как учение.

Микробиология (Microbiology) -  учение о микро-жизни, изучение самых мелких живых существ, которые не видимы невооруженным глазом ( - the study of micro-life, the study of the smallest living beings that are not visible to the naked eye.).

одноклеточные организмы микробиология

Парафилетическая группа живых организмов, тело которых состоит из одной клетки (в противоположность многоклеточным). Среди одноклеточных есть и прокариоты, и эукариоты. К ним относятся все археи, бактерии и большая часть протист, а также некоторые растения и грибы. К одноклеточным организмам относятся:

Иногда термин «одноклеточные» ошибочно используется как синоним протист (лат. Protista).

Предмет, задачи изучения науки микробиология, медицинская микробиология

На вопрос, что изучает микробиология, можно ответить так:
она изучает внешнее многообразие бактерий по форме и размерам, их влияние на окружающую среду и на живые организмы, способы питания, развития и размножения микроорганизмов, а также их влияние на хозяйственную и практическую деятельность человека. 

Микроорганизмы - это существа, способные обитать в самых разнообразных условиях. Для них практически нет пределов по температуре, по кислотности и щелочности среды, давлению и влажности. При любых условиях существует хотя бы одна (а чаще всего множество) группа бактерий, способная выживать.

Известны сообщества микроорганизмов, которые заселяют совершенно анаэробные условия внутри вулканов, на дне термоисточников, в темных глубинах океанов, суровых условиях гор и скал и так далее. Науке известны сотни видов микроорганизмов, которые со временем складываются в тысячи.

Установлено, что это только малая толика того разнообразия, что есть в природе. Поэтому работы у микробиологов очень много.

Одним из самых знаменитых центров, в котором происходило подробное изучение микроорганизмов и всех процессов, с ними связанных, являлся Пастеровский институт во Франции. Названный в честь знаменитого основателя микробиологии как науки Луи Пастера, этот институт микробиологии выпустил из своих стен массу замечательных специалистов, которыми были совершены не менее замечательные и значительные открытия.

Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН

Существет институт микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН (научное учреждение в области общей микробиологии и вирусологии — систематики, экологии, генетики и биотехнологии микроорганизмов и вирусов. В 2015 году в результате реорганизации вошёл в состав ФИЦ «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН.), который является самым крупным исследовательским центром в области микробиологии в нашей стране. 

История микробиологии, микробиологическая наука

морфологический или описательный; физиологический или накопительный; современный. В целом, история микробиологии насчитывает в своем развитии около 400 лет. То есть начало возникновения приходится примерно на XVII век. Поэтому и считается, что она достаточно молодая наука в сравнении с другими разделами биологии.

Морфологический или описательный этап микробиологии

Морфологический или описательный этап Само название говорит о том, что на данном этапе проходило, строго говоря, просто накопление знаний о морфологии бактериальных клеток. Началось все с открытия прокариот. Данная заслуга принадлежит родоначальнику микробиологической науки итальянцу Антонио ван Левенгуку, который обладал острым умом, цепким взглядом и хорошим умением логически мыслить и обобщать.

Смог изготовить линзы, дающие увеличение в 300 раз. Причем повторить его достижение смогли только в середине XX века русские ученые. И то не вытачиванием, а выплавкой линз из оптического стекловолокна. Вот эти линзы и послужили материалом, через который Левенгук обнаружил микроорганизмы. Причем изначально он ставил перед собой задачу весьма прозаичного характера:
ученого интересовало, почему хрен такой горький. Растерев части растения и рассмотрев их под микроскопом собственного производства, он и увидел целый живой мир крошечных созданий. Было это в 1695 году. С этих пор Антонио начинает активно изучать и описывать различные виды бактериальных клеток. Он различает их только по форме, однако и это уже немало. 

Левенгуку принадлежит около 20 рукописных томов, которые описывают подробно шаровидные, палочковидные, спиральные и другие виды бактерий. Им написан первый труд по микробиологии, который называется "Тайны природы, открытые Антони ван Левенгуком". Первая попытка систематизировать и обобщить накопленные знания по морфологии бактерий принадлежит ученому О. Мюллеру, который предпринял ее в 1785 году. С этого момента история развития микробиологии начинает набирать свои обороты. 

Физиологический или накопительный этап микробиологии

Физиологический или накопительный этап На данном этапе развития науки были изучены механизмы, лежащие в основе жизнедеятельности бактерий. Рассмотрены процессы, в которых они принимают участие и которые без них невозможны в природе. Была доказана невозможность самозарождения жизни без участия живых организмов. Все эти открытия были совершены в результате экспериментов великого ученого-химика, но после этих открытий еще и микробиолога, Луи Пастера.

Сложно переоценить его значение в развитии этой науки. История микробиологии вряд ли сумела бы развиться так быстро и полно, если бы не этот гениальный человек. 

доказал, что знакомый людям издревле процесс брожения сахаристых веществ обусловлен наличием определенного вида микроорганизмов. Причем для каждого вида брожения (молочно-кислое, спиртовое, масляное и так далее) характерно наличие специфической группы бактерий, которые его и осуществляют; ввел в пищевую отрасль процесс пастеризации для избавления продуктов от микрофлоры, вызывающей их гниение и порчу; ему принадлежит заслуга повышения иммунитета к болезням путем введения вакцины в организм. То есть Пастер - родоначальник прививок, именно он доказал, что болезни вызываются наличием болезнетворных бактерий; разрушил представления об аэробности всего живого и доказал, что для жизни многих бактерий (маслянокислых, например) кислород вообще не нужен, и даже вреден. Главной неоспоримой заслугой Луи Пастера стало то, что все свои открытия он доказывал экспериментально. 

Нет сомнений в справедливости полученных результатов. Но на этом история микробиологии, конечно, не заканчивается.

Значимыс ученым, работавшим в XIX веке и внесшим неоценимый вклад в изучение микроорганизмов, стал Роберт Кох - немецкий ученый, которому принадлежит заслуга выведения чистых линий бактериальных клеток.

Микроорганизмы тесно взаимосвязаны между собой в природе, одни группы в процессе жизнедеятельности создают питательную среду для другой, другая делает тоже самое для третьей и так далее.

То есть это те же цепи питания, что и у высших организмов, только внутри бактериальных сообществ. Вследствие этого очень сложно изучить какое-то отдельное сообщество, группу микроорганизмов, ведь их размеры чрезвычайно малы (1-6 м или 1 мкм) и, находясь в постоянном тесном взаимодействии между собой, они не поддаются тщательному изучению поодиночке. Идеальной представлялась возможность вырастить множество идентичных клеток бактерий одного сообщества в искусственных условиях. То есть получить массу одинаковых клеток, которые будут видны невооруженным глазом и изучить процессы у которых станет значительно легче.

Выведение чистых культур бактерий на питательной среде

Данное открытие сделал Кох -  ввел в обиход выведение чистых культур бактерий на питательной среде, которая для каждого сообщества своя. Также ему принадлежат заслуги в окрашивании колоний микроорганизмов и отдельных ее участников. Роберт Кох первым открыл туберкулезную палочку (палочку Коха), паразитирующую в животных и человеке. 

Использовал метод заражения подопытных животных болезнетворными (патогенными) бактериями с целью выведения чистых культур таких микроорганизмов и разработал методы дезинфекции и борьбы с ними. Таким образом было накоплено множество ценных сведений о жизнедеятельности бактерий, их пользе и вреде для человека. Развитие микробиологии пошло еще более интенсивным путем.

Современный этап микробиологии

Современный этап Современная микробиология - это целый комплекс подразделов и мини-наук, которые занимаются изучением не только самих бактерий, но и вирусов, грибков, архей и всех известных и вновь открываемых микроорганизмов. На вопрос, что такое микробиология, сегодня можно дать очень полный и развернутый ответ. Это комплекс наук, занимающихся изучением жизнедеятельности микроорганизмов, их применения в практической жизни человека в разных областях и сферах, а также влияния микроорганизмов друг на друга, на окружающую среду и живые организмы.

Обширным понятием микробиологии следует привести современную градацию данной науки на разделы. Общая. Почвенная. Водная. Сельскохозяйственная. Медицинская. Ветеринарная. Космическая. Геологическая. Вирусология. Пищевая. Промышленная (техническая).

Разделы микробиологии

Разделы микробиологии занимается подробным изучением микроорганизмов, их влияния на жизнь и здоровье людей и животных, а также возможности использования бактерий в практических целях для улучшения качества жизни человечества. Все это в комплексе и есть то, что изучает микробиология. 

Наибольший вклад в развитие современных методов микробиологии, способов выведения и возделывания штаммов микроорганизмов внесли такие ученые, как Вольфрам Циллиг и Карл Штеттер, Карл Везе, Норман Пейс, Уотсон Крик, Полинг, Цукеркандль.

Отечественные ученые микробиологи, изучение микробиологии

Из отечественных ученых это такие имена, как

И. И. Мечников; Л. С. Ценковский; Д. И. Ивановский; С. Н. Виноградский; В. Л. Омелянский; С. П. Костычев; Я. Я. Никитинский; Ф. М. Чистяков; А. И. Лебедев; В. Н. Шапошников;

Благодаря работам перечисленных ученых, были созданы способы борьбы с серьезными болезнями животных и людей (сибирская язва, сахарный клещ, ящур, оспа и так далее).

Созданы способы повышения иммунитета к бактериологическим и вирусным заболеваниям, получены штаммы микроорганизмов, способных перерабатывать нефть, создавать в процессе жизнедеятельности массу различных органических веществ, очищать и улучшать экологическую обстановку, разлагать нераспадающиеся химические соединения и многое другое.

Вклад специалистов и настоящих исследователей неоценим, поэтому некоторые из них (Мечников И. И.) получили Нобелевскую премию за свои работы.

Существуют дочерние науки, образовавшиеся на основе микробиологии, которые являются самыми передовыми в биологии - это биотехнология, биоинженерия и генная инженерия.

Работа каждой из них направлена на получение организмов или группы организмов с заранее заданными свойствами, удобными человеку. На выведение новых методов работы с микроорганизмами, на получение максимальной выгоды от использования бактерий. Таким образом, этапы развития микробиологии хотя и немногочисленны, однако очень содержательны и полны событиями. 

микробиология, методы изучения микроорганизмов

Многие используемые методы микробиологии основаны на работе с чистыми культурами, а также использовании новейших достижений техники (оптической, электронной, лазерной и так далее). Вот основные из них. Использование микроскопических технических средств. Как правило, только световые микроскопы полного результата не дают, поэтому применяются также люминесцентные, лазерные и электронные. Посевы бактерий на специальных питательных средах для выведения и культивирования абсолютно чистых колоний культур. Физиолого-биохимические методы анализа культуры микроорганизмов.

Молекулярно-биологические методы анализа. Генетические методы анализа.

Возможно проследить генеалогическое древо практически каждой открытой группы микроорганизмов. Это стало возможным благодаря работам Карла Везе, который сумел расшифровать участок генома колонии бактерий. С этим открытием стало возможным построение филогенетической системы прокариот. 

Использование изложенных методов позволяет получать полную и подробную информацию о любом из вновь открывающихся или уже открытых микроорганизмов и находить им правильное применение.

Этапы микробиологии, которые она прошла в своем становлении как наука, не всегда включали такой щедрый и точный набор методов.

Самым действенным в любые времена является метод экспериментальный, именно он послужил основой для накопления знаний и умений в работе с микромиром. 

Микробиология в медицине, медицинская микробиология

Один из наиболее важных и значимых именно для человеческого здоровья разделов микробиологии является медицинская микробиология. Предметом ее изучения стали вирусы и патогенные бактерии, которые вызывают тяжелые заболевания. Поэтому перед медиками-микробиологами стоит задача:

выявить патогенный организм, культивировать его чистую линию, изучить особенности жизнедеятельности и причины, по которым наносится вред организму человека, и найти средство для устранения данного действия. После того как чистая культура патогенного организма будет получена, необходимо провести тщательный молекулярно-биологический анализ.

На основе результатов провести испытание устойчивости организмов к антибиотикам, выявить пути распространения заболевания и выбрать наиболее эффективный метод лечения против данного микроорганизма. Именно медицинская микробиология, в том числе ветеринарная, помогла решить ряд злободневных проблем человечества:

созданы вакцины против сибирской язвы, бешенства, рожи непарнокопытных, оспы овец, анаэробных инфекций, туляремии и паратифа, стало возможным избавление от чумы и парапневмонии и так далее. 

Пищевая микробиология, санитария и гигиена

Основы микробиологии, санитарии и гигиены тесно взаимосвязаны между собой и вообще едины. Ведь патогенные организмы способны распространяться гораздо быстрее и в большем объеме, когда условия санитарии и гигиены оставляют желать лучшего.

Используется в пищевой промышленности, при массовых производствах различных продуктов питания для человека.

Морфология и физиология микроорганизмов, биохимические процессы микроорганизмов

Данные о морфологии и физиологии микроорганизмов, биохимических процессах, вызываемых ими, а также влияние экологических факторов на микрофлору, развивающуюся в продуктах питания при транспортировании, хранении, реализации и переработке сырья, позволяют избежать многих проблем.

Роль микроорганизмов в процессе формирования и изменения качества пищевых продуктов и возникновения ряда заболеваний, вызываемых патогенными и условно-патогенными видами, весьма значительна, и поэтому задачей пищевой микробиологии, санитарии и гигиены является эту роль выявить и повернуть на благо человеку.

Пищевая микробиология культивирует бактерии, способные преобразовывать из нефти белки, использует микроорганизмы для разложения пищевых продуктов, для обработки многих товаров питания. Процессы брожения на основе молочно-кислых и масляно-кислых бактерий дают человечеству множество необходимых продуктов. Вирусология Совершенно отдельная и очень большая группа микроорганизмов, которая на сегодняшний день является самой малоизученной - это вирусы.

Микробиология и вирусология

Стоит отметить, что микробиология и вирусология взаимосвязанные категории микробиологической науки, которые изучают патогенные бактерии и вирусы, способные нанести тяжкий вред здоровью живых организмов.

Вирусология раздел очень обширный и сложный, поэтому заслуживает отдельного изучения.