Подсчет клеток микроорганизмов под микроскопом, микробиология

Подсчет клеток микроорганизмов под микроскопом, микробиология

Подсчитать клетки микроорганизмов под микроскопом можно используя счетные камеры, капилляры Перфильева, препараты фиксированных и окрашенных клеток, приготовленные на предметных стеклах или мембранных фильтрах. Перечисленные методы позволяют определить общее количество клеток в единице объема. Следует помнить, что подсчитывают все клетки, как живые, так и мертвые. Подсчет клеток в счетных камерах. Этот метод рекомендуется использовать для подсчета крупных объектов - дрожжей, одноклеточных водорослей, конидий грибов и некоторых относительно крупных бактерий.

используют камеру Горяева - Тома, хотя можно применять и другие счетные камеры. При работе с камерой необходимо соблюдать определенный порядок ее заполнения. Вначале углубление с сеткой покрывают специальным шлифованным покровным стеклом и, слегка прижимая, смещают покровное стекло в противоположные стороны до появления колец Ньютона. Эти кольца указывают на то, что покровное стекло притерто к сторонам камеры. Только при таком условии объем взвеси микроорганизмов, находящийся в камере, соответствует расчетному. После этого камеру заполняют исследуемой суспензией микроорганизмов. Суспензию вносят через бороздку камеры капилляром или пипеткой.

Подсчет клеток рекомендуется начинать через 3 - 5 мин после заполнения камеры, чтобы клетки осели и при микроскопировании были видны в одной плоскости. Подвижные клетки перед заполнением камеры убивают нагреванием или суспендированием в 0,5%-ном водном растворе формалина. Число клеток подсчитывают с объективом 8х или 40х. С иммерсионным объективом работать нельзя, так как его фокусное расстояние меньше толщины стекла камеры. Обычно подсчитывают клетки микроорганизмов в 10 больших или 20 маленьких квадратах сетки, перемещая последние по диагонали. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также клетки, пересекающие верхнюю и правую стороны квадрата. При подсчете количество клеток в большом квадрате не должно превышать 20, а в малом - 10, в противном случае исходную суспензию разводят водопроводной водой. Для получения достоверного результата общее число подсчитанных клеток микроорганизмов должно быть не менее 600. Подсчет клеток повторяют 3 - 4 раза, каждый раз заново монтируя камеру и заполняя ее исследуемой взвесью микроорганизмов. Это обеспечивает большую точность, чем подсчет 600 клеток при однократном монтаже камеры. Количество клеток в 1 мл исследуемой суспензии вычисляют по формуле
хл АЛ°
3
М =-------- и,
hS где

М- число клеток в 1 мл суспензии;
А - среднее число клеток в 1 квадрате сетки;
h - высота камеры, мм; . S - площадь 1 квадрата сетки, мм2 ; 103 - коэффициент перевода кубических сантиметров в кубические миллиметры;
п - разведение исследуемой суспензии. Подсчет клеток на фиксированных окрашенных мазках (метод Виноградского-Брида). 

Преимущество метода заключается в том, что фиксированные окрашенные препараты хорошо сохраняются, поэтому подсчет можно проводить в удобное для исследователя время. Для этого хорошо обезжиренное предметное стекло помещают на миллиметровую бумагу, на которой отмечен прямоугольник площадью 4 или 6 см2. Затем на стекло из микропипетки наносят точно измеренный объем исследуемой суспензии (0,01, 0,02 или 0,03 мл) и каплю 0,03 - 0,1%-ного водного раствора агара. Нанесенную суспензию равномерно распределяют петлей по площади, отмеченной на миллиметровой бумаге. Препарат подсушивают на воздухе, фиксируют 10-20 мин 96%-ным спиртом и окрашивают 1 - 2 мин фуксином Циля или любым другим красителем. Краситель сливают, препарат промывают, последовательно погружая стекло в 4 - 5 стаканов с водой (промывать препарат под струѐй водопроводной воды не следует), и высушивают на воздухе.

В таком виде препараты хорошо сохраняются. Количество клеток подсчитывают с иммерсионным объективом в квадратах окулярной сетки, которую помещают в окуляр между собирательной и глазной линзами. При отсутствии сетки подсчитывают число клеток в поле зрения микроскопа.

Чтобы результат был достоверным, клетки микроорганизмов рекомендуется подсчитывать в 50 - 100 полях зрения. Общее количество подсчитанных клеток не должно быть менее 600. Количество клеток микроорганизмов, содержащихся в 1 мл исследуемого субстрата, вычисляют по формуле »• AS М =---- п, sV где

М - количество клеток в 1 мл исследуемого субстрата;
А - среднее число клеток в квадрате окулярной сетки (поле зрения);

s - площадь квадрата окулярной сетки (поля зрения), мкм2 ;
V - объем нанесенной на стекло суспензии, мл;
S - площадь приготовленного мазка, мкм ;
п - разведение исследуемого субстрата.

Подсчет клеток на мембранных фильтрах

Этот метод применяют при определении количества микроорганизмов в различных водоемах, при санитарно-бактериологических и некоторых других исследованиях. Фильтрование пробы определенного объема (от нескольких миллилитров до десятков литров) позволяет сконцентрировать на поверхности фильтра содержащиеся в пробе клетки микроорганизмов. Затем их окрашивают и подсчитывают.