Главная » Статьи » Статьи из журналов по химии » Гистохимия Пущинский Госуниверситет Учебное пособие

Гистохимия Пущинский Госуниверситет Учебное пособие

Гистохимия Пущинский Госуниверситет Учебное пособие. Гистохимия, методы гистохимии учебное пособие. Пущинский Госуниверситет Учебное пособие

1. Предмет гистохимии, краткая история
2. Микротехника
3. Свет, красители, микроскопия
4. Типы гистохимических реакций

Электронный макет учебного пособия Основы гистохимии подготовлен в Электронном издательстве -Аналитическая микроскопия- (рег. Свидетельство Эл № 77- 6072 Министерства РФ по делам печати, телерадиовещания и средств массовой информации от 4 февраля 2002 г.) O Электронное издательство -Аналитическая микроскопия” , Пущино, 2008 г.

ОСНОВЫ ГИСТОХИМИИ Раздел 1. Предмет гистохимии. Краткая история. Программа курса

Содержание курса.
Глава 1. Предмет и цели гистохимии
Глава 2. Основные вехи в истории гистохимии

Контрольные вопросы
Рекомендуемая литература
Приложение: Программа курса -Основы гистохимии-

Спецкурс «ОСНОВЫ ГИСТОХИМИИ»,

Программу данного спецкурса в приложении к первому разделу электронного учебного пособия). Компьютерный вариант учебника выполнен в виде четырех разделов и представляет краткий конспект лекций и семинарских занятий по основным разделам учебной Программы.

пособие предназначено для самостоятельной работы магистрантов, для подготовки, наряду с рекомендуемой к каждому разделу учебника литературой, к коллоквиумам, зачету и экзамену.

При составлении данного учебного пособия автор стремился сосредоточить внимание магистрантов на главных принципиальных вопросах и проблемах гистохимии, не загружая лекционный материал конкретными методиками. Последние разбираются в ходе обучения на семинарах и практических занятиях. Главная цель данного руководства заключается в развитии у обучаемых представления об основных преимуществах, проблемах и недостатках гистохимического анализа, о
технологии гистохимического метода, о связи гистохимического метода с аналитической биохимией.

В с вязи с тем, что реализация гистохимического метода в большинстве случаев связана с использованием красителей и всегда микроскопии, особое внимание уделено  збранному материалу по оптике, красителям и микроскопии. Данная версия учебного пособия по Основам гистохимии, содержащая краткий конспект курса лекций, читаемых автором для магистрантов Пущинского Государственного Университета с 1995 г.

1. ПРЕДМЕТ ГИСТОХИМИИ. КРАТКАЯ ИСТОРИЯ.

2. МИКРОТЕХНИКА — Фиксация (химическая и физическая) микротомия и работа со срезами ткани.

3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СВЕТА С ВЕЩЕСТВОМ — Избранные разделы геометрической и физической оптики. Красители. Микроскопия.

4. ТИПЫ ГИСТОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ — Классификация гистохимических реакций, краткая характеристика основных типов гистохимических реакций. При подготовке данной версии большую помощь оказали сотрудники Лаборатории функциональной гистохимии Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН и магистранты Пущинского Государственного Университета, за что автор приносит им искреннюю благодарность.

В заключение автор обращается с просьбой к пользователям данного компьютерного учебника: все замечания и конструктивные предложения по улучшению данного пособия сообщить в Лаборатори. Функциональной гистохимии: Ваши замечания будут с благодарностью приняты и использованы в работе над дальнейшими версиями учебного пособия.Желаю успеха! проф. А.Ю.Буданцев декабрь 2007 г. ПущиноГлава 1. Предмет и цели гистохимии. Современная цитология и гистология включают комплексное
изучение общебиологических явлений: движения, раздражимости, наследственности, индивидуального и эволюционного развития, адаптации и патологических процессов на клеточном и тканевом уровне организации живой материи. В настоящее время эти науки уже не являются чисто морфологическими дисциплинами, как было в начальных стадиях их развития и включают данные о физико-химических процессах на клеточном и тканевом уровнях и молекулярной организации клеток и тканей. Такой подход дает возможность развивать всеобъемлющий взгляд на сущность процессов регуляции основных биологических явлений в клетках и тканях и представлять общую картину взаимосвязанных клеточных процессов и межклеточных коммуникаций. Задачи и цели современной гистохимии как науки, в самом общем виде, связаны с исследованием химических реакций в живых клетках. В такой формулировке, цели и задачи гистохимии полностью совпадают с задачами биохимии. Однако подход к изучению совокупности химических реакций в клетках и тканях, т.е. метаболизма, в случае гистохимии имеет одно принципиальное отличие от биохимического подхода: главная догма гистохимии – изучение метаболизма при условии сохранения морфологической целостности клеток и тканей. Все, что писал Д.Мецлер в своем знаменитом учебнике -Биохимия- относительно того, что биохимия занимается исследованием -…непрерывных, сложных последовательных химических реакций, благодаря которым клетки растут и делятся, питаются и выделяют шлаки, движутся и сообщаются друг с другом…В равной степени можно отнести и к гистохимии, но гистохимический анализ должен проводиться при сохранении структурной организации объектов исследования.

В настоящее время нельзя найти ни одно направление биологии, где гистохимический анализ не был бы использован. Это в равной степени относится к изучению принципов физико-химической организации клеток и тканей, к изучению вопросов регуляции всех метаболических систем клеток в норме и при патологических состояниях. В капитальном труде -Гистохимия- Э.Пирс писал: -…Вклад гистохимии во все области, где она нашла применение значителен. Гистохимия позволяет превратить описательные науки в динамические и функциональные… Совершенно очевидно, также как и развитие любого научного направления, прогресс цитологии и гистологии обусловлен в значительной степени успехами в разработке новых методов исследования. Эти методы, связаны прежде всего, с методами физики, аналитической биохимии, молекулярной биологии и иммунологии, изящно адаптированными для целей цитологии и гистологии.

Гистохимия, как научное направление, оформилось в середине XIX века и ее основателем считается французский фармацевт, ботаник и микроскопист Франсуа Винсент Распайль (F.V.Raspail) (1794-1878). Он опубликовал свои первые работы по ботанической гистохимии в 20-30х годах XIX-го века (F.V.Raspail, A new system of organic chemistry, Translate Hendorson W., London, 1834). …Несомненно, первое ясное понимание и правильная оценка микроскопической химии тканей как науки… (Э.Пирс, 1962) принадлежит работам Ф.В.Распайля выполненным в 1825-1829 годах. Изучая процесс оплодотворения у Graminaceae (злаковые), Ф.В.Распайль использовал иодную реакцию на крахмал. В 1829 году он впервые применил ксантопротеиновую реакцию на белки, ему приписывается открытие микросжигания для изучения неорганических соединений в тканях, он был первым исследователем, который занимался определением рН протоплазмы с использованием индикаторных красителей (лакмус).
7
Н а иболее полное описание истории гистохимии можно найти в энциклопедическом труде Э.Пирса, Гистохимия (теоретическая и прикладная), ИИЛ, М., 1962-.
Вкратце, необходимо отметить, что вначале гистохимия развивалась, в основном, в области изучения ботанических задач. Во второй половине XIX века гистохимия представляла раздел биохимии животных, а в конце века часть гистохимии дополнительно начала рассматриваться как раздел физиологии животных и только в 30х годах прошлого столетия гистохимия вновь рассматривается в составе наук о тканях и клетках. Становление современной гистохимии и оформление ее как самостоятельного научного направления несомненно связано с появлением в 50-х годах XX столетия ряда крупных специализированных научных журналов: Experimental Cell Research (1950); Journal of Histochemistry and Cytochemistry (1953), Acta Histochemia (1954); Journal of Biophysical and Biochemical Cytology (1955); Rivista di Histochimica (1955); Annales d'Histochemie (1956); Histochemie (1958). До появления этих журналов, специальные статьи по гистохимии публиковались в основном в журнале Stain Technology (1925, с 1991 г. журнал называется Biotechnic and Histochemistry) и в многочисленных журналах по микроскопии и микроскопической анатомии (J.Roy.Microscop.Soc., (1857?), Z.mikr.anat. Forsch.(1924), Архив анатомии, гистологии и эмбриологии (1916) и мн. др.).

В конце 50-х годов опубликованы две классические книги крупнейшего бельгийского цитолога Жана Браше Биохимическая цитология (1957) и Биохимическая эмбриология (1960), в которых автором приведено скрупулезное изучение цитофизиологии клеток (цитоплазма и ядро покоящейся клетки, взаимодействие ядра и цитоплазмы у одноклеточных организмов, при эмбриональной дифференцировке и при малигнизации клеток). На примере изучения, в основном, нуклеиновых кислот в клетках при помощи цитохимических методов, Ж.Браше показал огромные возможности цитохимии для клеточной биологии и обозначил цитохимию
как Биохимическую цитологию.

Гистохимия и цитохимия развиваются на стыке различных наук и, прежде всего, на стыке гисто- и цитологии, биохимии, аналитической химии и клеточной биофизики. Кроме этого, необходимо отметить, что развитие и совершенствование гистохимии связано с развитием химии красителей, разработкой оптических и оптико-электронных приборов (микроскопы и анализаторы изображений), развитием теоретической и прикладной оптики (микрофотометрия) и ряда биологических наук — иммунологии, клеточной инженерии, молекулярной биологии. П оследние достижения гистохимии связаны с изящным применением некоторых методов молекулярной биологии нуклеиновых кислот, что привело к разработке специальной гистохимической технологии, которая вошла в научную литературу под названием гибридизация мРНК in situ и расцвету иммуноцитохимии и иммуногистохимии.

Глава 2. Основные вехи в истории гистохимии Как указывалось выше история развития гистохимии как научного направления детально описана у Э.Пирса (1962). В несколько дополненном виде можно выделить следующие основные вехи в истории развития гистохимии. 1800-1829 г.г.

Отдельные сообщения об исследовании химических, а не морфологических структур в тканевых препаратах. Гистохимия еще не существует как самостоятельная наука. Сложные микроскопы начала-середины XIX века: слева — микроскоп фирмы -Уцшнейдер унд Фраунгофер-, Мюнхен, около 1820 г. Справа — сложный микроскоп Джованни Батиста Амичи, около 1845 г. (Йенский оптический музей, Приложение к журналу -Йенское обозрение-, 1975 г.) 1830-1855 г.г.

Становление гистохимии как науки. В период своего возникновения объектами гистохимии были, в основном, растительные клетки и ткани; многие десятилетия вся практическая гистохимия в точном смысле этого слова была сосредоточена в руках ботаников. К этому времени относится появление целого ряда работ в данной области: Essai de Chimie Microscopique Appliquee a la Physiologie (1830) и Nouveau Systeme de Chimie Organique (1833) Ф.-В.Распайля, Lehrbuch der physiologischen Chemie (1842) К.Д.Лемана,  A New System of Organic Chemistry (1834) Ф.- В.Распайля (перевод). Франсуа-Винсент Распайль (1794-1878).

Основатель гистохимии (репродукция из книги Пирса Э. Гистохимия, ИИЛ, М. 1962) 1856-1871 г.г.

Гистохимия животных тканей в отличие от растительных тканей составляла, в основном, часть биологической химии и большая часть ее методов была основана на разрушении тканей. Появляется больше руководств, ориентирующихся именно на данное направление гистохимии; некоторые из них представляли собой перевод более ранних работ: Physiological Chemistry (1851) К.Д.Лемана (перевод), Traite de Chimie Anatomique (1853) К.Робина и Ф.Вердейля, Die Chemie der Gewebe des gesammten Thierreichs (1856) Дж.Е.Шлоссбергера, Handbuch der Experimental Physiologie der Pflanzen (1865) Дж.Сакса, Handbuch der Histologie und Histochemie des Menschen (1867) Г.Фрея. 1872-1898 г.г.В этот период произошло разделение гистохимии — одна ее часть отошла к физиологии, а другая присоединилась к биологической химии. Из числа статей и книг, появившихся в эти годы, заслуживают упоминания следующие: Ein Beitrag zur Histochemie (1874), Ф.Мишера, Histology and Histochemistry of Men (1874) Г.Фрея (перевод), Traite de Chimie Physiologique (1883) К.Д.Лемана (перевод), Lehrbuch der physiologischen und pfthologischen Chemie (1887) Дж.Бунге и Lectures on the Physiology of Plants (1887) Дж.Сакса. 1899-1929 г.г.В течение этого периода в гистологии получило широкое распространение применение анилиновых красителей, впервые описанное А.Бенке в 1862 г. В первой четверти ХХ в. наблюдалось быстрое развитие описательной гистопатологии.

Гистологи стали проявлять больший интерес к новым красителям и новым методам окрашивания и стали меньше интересоваться химией тканевых структур. Хотя многие из цветных реакций уже приобрели диагностическое значение, еще не было сделано попыток подвести под них химическую или физическую основу. Микротом фирмы -Рейхерт-, 1909 г. Морфологические исследования превалировали над гистохимическими, и Дж.Манн (1902) поступил опрометчиво, заявив, что изучение микроанатомии млекопитающих было почти завершено к 1900 г. Три классические работы этого периода посвящены микрохимии и микрофизиологии. Речь идет о Physiological Histology (1902) Дж.Манна, Encyclopadie der mikroskopischen Technik (1903) П.Эрлиха и Methoden und Ergebnisse der Mikrochemie (1908) А.Б.Макаллума. В 1911-1913 г.г. фирмами Рейхерт Карл Цейсс начали выпускаться люминесцентные микроскопы, что в последующие годы привело к развитию целого направления — люминесцентной гистохимии. А.Пренан (1910) в своей весьма ценной работе дал обзор общему состоянию гистохимии, а труд Г.Молиша Mikrochemie der Pflanzen (1913) содержал большое количество интересного гистохимического материала.

Другие работы, опубликованные в конце этого периода, свидетельствуют о новом расцвете гистохимии. Сюда относятся Review of Recent Developments in Histochemistry (1927) М.Пара, Animale Histochemie (1928) В.Патцельта, Prakticum der Histochemie (1929) Дж.Клейна и Histochemische Methoden (1929) Дж.Гертвига.

1930-1944 г.г. В этот период произошло возрождение гистохимии и ее частичное возвращение в сферу гистологии. Наиболее значительной работой этого периода явился труд Л.Лизона Histochimie Animale (1936), в котором автор ратует за новую гистохимию, без разрушения тканей. Невозможно переоценить влияние этой книги на развитие как теоретической, так и практической гистохимии. Труд Л.Лизона до 1953 г., когда вышло 2-е расширенное издание, был настольной книгой гистохимиков всех основных направлений. К другим прекрасным, и не менее значительным работам этого периода относятся -Handbook of Chemical Microscopy- (1930) Е.М.Шамо и В.Мазона, -Histochemische Methoden- (1932) Б.Ромейса, Die als Mikroveraschung histochemische Hilfsmethode )1932) А.Поликара и Г.Оккельса, Problems in Histochemistry (1936) К.Линдерстрем-Ланга. В 1936-1940 г.г. были опубликованы первые работы Т.Касперсона в области микрофотометрии, заложившие основы количественной абсорбционной цитохимии. В 1941-1942 г.г. появились первые работы А.Кунса и его отрудников, посвященные новому методу выявления белков при помощи меченных антител, что затем привело к большому направлению в гистохимии — иммуноцитохимии и иммуногистохимии.

1945-1956 гг. В 1948 Б.Ромейсом была опубликована Mikroskopische Technik (пятнадцатое издание!), которая до настоящего времени остается настольной книгой экспериментаторов-гистологов и гистохимиков (книга на русском языке вышла в 1954 г.). Одной из значительных работ, опубликованных в этот период, явилась книга Д.Глика Techniques of Histo- and Cytochemistry (1949). В этом труде лишь кратко излагаются теоретические и практические вопросы гистохимии в той мере, в какой они касаются гистолога. В нем отражен весь диапазон вопросов гистохимии с физиологической, физической и гистологической точек зрения, и многие из приведенных методических данных относятся к компетенции лишь специалистов данной узкой области. В 1949 г. вышла монография отечественного гистохимика А.Л.Шабадаша Гистохимия гликогена нормальной нервной системы, в которой автором предложены оригинальные методы выявления гликогена, которые затем широко использовались в мире. Мощный импульс развитию интравитальной микроскопии придала монография В.Ханзона (Acta Physiologica Scand., 1952, v.28 Suppl.101, 1-268), в которой изложены блестящие возможности изучения динамики секреции в печени при помощи интравитальной микроскопии. Спустя некоторое время, появились пять работ, в основном или исключительно посвященные гистохимии. Имеются в виду в порядке их выхода в свет Microscopic Histochemistry (1952) Дж.Гомори, Cytochemistry (1953) Дж.Ф.Даниелли, первое издание Гистохимии Э.Пирса (1953) второе издание Histochimie et Cytochimie Animales (1953) Л.Лизона и книга Л.И.Джапаридзе Практикум по микроскопической химии растений ( копия этой книги имеется в открытом доступе на Сервере. Раздел -Э лектронная библиотека. Книга Дж.Г.Бурна An Introduction to Funktional Histology (1953), хотя и задуманная не как руководство по гистохимии, была в значительной степени посвящена применению гистохимических методов, а второе издание монографии Р.Д.Лилли, с новым заглавием HistopathologicTechnic and Practical Histochemistry (1954), представляет собой важное дополнение к литературе по гистохимии, хотя она только частично посвящена этим вопросам (третье издание этой книги Р.Д.Лилли, 1965 переведено на русский язык и издано в 1969 г).

Критический и побуждающий к новым исследованиям обзор современного состояния гистохимии дал М.Виалли в своем труде Introducione alla Ricerca in Istochimica (1955); в этой книге автор обсуждает все достоинства и недостатки большинства направлений гистохимии. Доказательства того, что перспективы современной гистохимии все более расширяются, были приведены в книге Analytical Cytology (1955) под редакцией Р.Меллорса, труде целого ряда авторов, занимающихся всеми видами микроскопии и ее применением (перевод на русский язык в 1957 г.), а также в монографии О.Эренке Quantitative Methods in Histology and Microscopic Histochemistry (1955). Эти две книги касаются, в основном, количественной стороны гистохимии, дальнейшее развитие которой тесно связано с успехами именно в этом направлении. Быстро развивающаяся гистохимия, не имевшая вплоть до 1955 г. никаких собственных журналов или иных периодических изданий, кроме Stain Technology, насчитывает их теперь не менее семи; если же учитывать и те издания, в которых гисто- и цитохимические статьи составляют значительную или даже большую часть материала, то число их возрастет. Основными гисто- и цитохимическими журналами (в скобках приведен первый год публикации данного журнала) являются Experimental Cell Research (1950), Journal of Histochemistry and Cytochemistry (1953), Acta Histochemica (1954),Journal of Biophysical and Biochemical Cytology (1955), Rivista di stochimica (1955), Annales d'Histochimie (1956), Histochemie (1958). 1957-1970 г.г.

В 1957 г. вышла книга Ж.Браше Биохимическая цитология (в 1960 г. опубликована на русском языке), в которой были блестяще продемонстрированы возможности цитохимии для изучения ядра покоящейся клетки, митоза и роли взаимодействия ядра и протоплазмы клеток в эмбриональной дифференцировке и малигнизации. Монография Э.Пирса Histochemistry. Theoretical and Applied, вышедшая вторым изданием в 1962 г., была переведена на русский язык в 1962 году и заслуженно стала настольной энциклопедией по гистохимии. В 1962 г. вышла книга В.А.Дженсена (W.A.Jensen) Botanical Histochemistry. Princiles and Practice (издание на русском языке в 1965 г.), которая как и руководство по микротехнике и практической гистохимии венгерского исследователя Д.Кисели, опубликованное также в 1962 г., используется гистохимиками по настоящее время. Область ферментной гистохимии получила значительный импульс в развитии благодаря работам М.Берстона, суммированным в монографии Enzyme histochemistry and its application in the neoplasms, которая вышла в 1962 году и была переведена на русский язык в 1965 г. В 1962 году появились первые работы Б.Фалька и ряда блестящих шведских исследователей, которые заложили основу крупного направления в гистохимии — гистохимии биогенных моноаминов.

В последующие годы на основе метода Фалька-Хилларпа были выполнены работы по картированию моноаминсодержащих структур в мозге и сформулировано понятие о моноаминергических системах мозга и детально изучены их функции (см. А.Ю.Буданцев -Моноаминергические системы мозга, М., Наука, 1976). В 1966 г. вышли книга В.Г.Конарева Химия и гистохимия растений и сборник Introduction to Quantitative Cytochemistry, под редакцией Дж.Л.Вида (G.L.Wied), которая была переведена на русский язык в 1969 году и редакторами русского издания во вводной статье к сборнику приведена библиография более 200 работ отечественных авторов по гистохимии в период с 1955 по 1968 г.г. В 1967 г. опубликованы две заслуживающих внимания книги — В.Брауна, А.Лемана и Г.Таубера (W.Braune, A.Leman, H.Taubert) PflanzenanatomischesPraktikum, представляющая прекрасное практическое руководство по растительной гистологии и монография А.В.Зеленина -Люминесцентная цитохимия нуклеиновых кислот (1967 г.), содержащая некоторые итоги, полученные одним из учеников отечественной школы люминесцентных микроскопистов, воспитанных и работавших под руководством М.Н.Мейселя.

1971-1980 г.г. Итоги достижений по гистохимии на уровне электронного микроскопа подведены в монографии Г.Гайера Ultrahistochemie (1973), которая
вышла у нас под названием Электронная гистохимия (1974). Проблемы и достижения люминесцентного спектрального анализа клеток изложены в монографии В.Н.Карнаухова (1978) на примере изучения нуклеиновых кислот с помощью акридинового оранжевого и других флуорохромов. Гистохимическое изучение ферментов нашло отражение в монографии З.Лойда и др. (Z.Lojda, R.Grossau,T.H.Schiebler) Гистохимия ферментов. Лабораторные методы (1979) (перевод на русском языке в1982 г.). В 1980 г. был опубликован уникальный справочник Д.М.Фрайштадта Реактивы и препараты для микроскопии, в котором приведена необходимая информация о приблизительно 900 химических реактивах и красителях используемых для гистологии и гистохимии. 1981-2000 г.г.

Можно отметить, что в последние годы наблюдается мощное развитие методов иммуноцитохимии и иммуногистохимии и широкое их использование в экспериментальных исследованиях. Многотомное издание Handbook of Chemical Neuroanatomy выходящее с начала 80-х годов под редакцией А.Бьерклунда и Т.Хокфельта практически полностью составлено из работ проведенных при помощи иммуногистохимических методов. В начале 90-х годов вышли в свет крупные многотомные монографии по иммуноцитохимии, A.C.Cuello Immunohistochemistry II (1993), в 1984 г. вышло практическое руководство по иммуногистохимии Дж.Поллак и С.Ван Норден, которое было переведено на русский язык в 1987 (Введение в иммуноцитохимию. Современные методы и проблемы). Но наиболее важным событием в 80-90-х годах была разработка метода гибридизации мРНК in situ и использование этого метода для изучения распределения мРНК в разных тканях в норме и при различных экспериментальных ситуациях. Этот метод позволяет получить важную и уникальную информацию о местах внутриклеточного синтеза эндогенных белков (Wilkinson D.G. In situ Hibridization,1992 г. — практическое руководство). М.В.Угрюмов (1994) опубликовал детальное практическое руководство по иммуногистохимии и гибридизации in situ). Из новых технических средств используемых в гистохимии необходимо отметить развитие аппаратуры и методов для проточной цитофлуориметрии (Ormerod M.G., Flow cytometry. A practical approach, 1990; A.Radbruch, Flow cytometry and cell sorting (1992); M.R.Melamed et al. Flow cytometry and sorting (1990, 2nd ed), конфокальной микроскопии и внедрение телевизионно-компьютерных технологий в микроскопию для микроспектрофотометрии и трехмерной реконструкции результатов гистохимического анализа. В 1996 г. в России вышел сборник -Микроскопическая техника- под руководством Д.С.Саркисова и Ю.Л.Перова — ведущих специалистов в области медицинской гистологии и гистохимии. 2001-2007 г.г.

Мощное развитие методов оптической аналитической микроскопии, особенно развитие конфокальной микроскопии и разных других методов флуоресцентной микроскопии, которые нашли применение в изучении живых клеток (Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP), Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)). Появился ряд обзоров под названиями: -Будущее прекрасно…The Future looks Bright…и Focus on Fluorescence Imaging… в журналах Science и Nature Methods (Science, v.300,N5616, 2003; Nature Methods, v.2, No.12, Dec.2005), посвященных обсуждению разных типов флуоресцентной и видеомикроскопии, применению -зеленых белков- как флуоресцентных белковых маркеров при изучении живых клеток, возможности использования захвата последовательности видеоизображений для изучения поведения живых клеток и мн. др. Инвертированный микроскоп IX71 (фирма Олимпус) с видеокамерой для изучения живых клеток (ИТЭБ РАН, Центр аналитической микроскопии) Наблюдается бурное развитие работ с использованием метода гибридизации мРНК in situ и методов иммуноцитохимии. В капитальном сборнике -Нанотехнология- приведено много данных о применимости разных вариантов силовой микроскопии высокого разрешения для изучения биологических объектов и использование принципов и достижений нанотехнологии в биологии (Springer Handbook of Nanotechnology, Ed.Prof. Bharat Bhushan, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2004).

Контрольные вопросы
1. Предмет и задачи гистохимии
2. Основные методы гистохимии. Гистохимия — междисциплинарная наука
3. Начало современной гистохимии
4. Основные вехи в развитии гистохимии
5. Современное развитие гистохимии, основные направления развития. Основные
гистохимические журналы
6. Новейшие направления развития гистохимии
7. Значение гистохимии для фундаментальных и прикладных исследований в биологии и медицине

Литература
1. Кисели Д. Практическая микротехника и гистохимия, Изд. АН Венгрии, Будапешт, 1962
2. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. Мир, М., 1980
3. Пирс Э. Гистохимия. Теоретическая и прикладная. ИИЛ, М., 1962
4. Конарев В.Г. Цитохимия и гистохимия растений, М., Высшая школа, 1965
5. Дженсен У. Ботаническая гистохимия, М., Мир, 1965
6. Микроскопическая техника. Руководство. Под ред. Д.С.Саркисова и Ю.Л. Перова, Медицина, М., 1996, гл.1-4.
7. Gahan P.B. Plant histochemistry and cytochemistry. An introduction. Academic Press, London, 1984

ПРОГРАММА курса Основы гистохимии ВВЕДЕНИЕ. Предмет и задачи гистохимии. Основные методы гистохимии. Гистохимия — междисциплинарная наука. Первые работы по гистохимии; Начало современной гистохимии. Основные вехи в развитии гистохимии. Современное развитие гистохимии, основные направления развития. Основные гистохимические журналы. Новейшие направления развития гистохимии. Значение гистохимии для фундаментальных и прикладных исследований в биологии и медицине.

МИКРОТЕХНИКА (ОСНОВЫ ГИСТОЛОГИЧЕСКОЙ ТЕХНИКИ) ХИМИЧЕСКАЯ ФИКСАЦИЯ. Общие задачи химической фиксации. Проблемы химической фиксации, артефакты. Действие формалина на ткань. Альдегиды, используемые для приготовления химических фиксаторов. Особенности применения формалина как фиксатора, параформ. Глутаральдегид как химический фиксатор. Взаимодействие белков с альдегидами. Использование альдегидной фиксации в гистохимии. Связь структуры альдегидов с их фиксирующей способностью. Гидролиз метиленовых мостиков (использование в гистохимии). Влияние температуры и длительности фиксации в альдегидах на сохранения ткани. Основные типы альдегидной фиксации (3 типа фиксации). Буферы и альдегидная фиксация. Хранение альдегидных фиксаторов. Формалиновые смеси (фиксаторы): жидкость Бэкера, Шабадаша, смесь Пирсона, солевой забуференный формалин. Ионы металлов как фиксаторы. Хромовая кислота, основные свойства, область использования. Хромовая кислота — механизм фиксации. Смесь Мюллера. Жидкость Ценкера. Соли ртути, механизмы фиксации, область использования в гистохимии. Смесь сулема — уксусная кислота. Четырехокись осмия, основные механизмы фиксации, область использования в гистохимии. Пикриновая кислота, механизмы фиксации. Смесь Боуэна. Сульфосалициловая кислота, механизмы фиксации. Трихлоруксусная кислота, механизмы действия. Спирты как фиксаторы для гистохимии, механизмы действия. Спиртовые смеси (Жидкость Карнуа). Ацетон — химический фиксатор, механизмы действия.

ФИЗИЧЕСКАЯ ФИКСАЦИЯ. Что такое физическая фиксация. Использование низких температур, общие принципы. Зависимость скорости реакций от температуры, уравнение Аррениуса. Кристаллизация воды в тканях, значение для фиксации. Общая классификация криометодов фиксации тканей для гистохимии. Прямое замораживание тканей (до -10 — -20 град. С, без дегидратации). Глубокое замораживание тканей (до -78 — -196 град. С, без дегидратации). Замораживание тканей при помощи твердой углекислоты. Жидкий азот, замораживание ткани, скорость замораживания, использование промежуточных жидкостей (изопентан, пропан). Сублимационная сушка тканей как физическая фиксация. Общие принципы сублимационной сушки. Общие физические процессы при вакуумной сублимации воды из замороженной ткани. Влияние температуры ткани на скорость сублимации воды. Конструкция вакуумного сублиматора и скорость сушки (свободный пробег молекул воды). Температурный режим сублимации замороженной ткани. Определение конца сублимации. Сопротивление высушенного слоя. Артефакты при сублимационной сушке, методы их уменьшения. Основные приемы обработки лиофилизированной ткани для гистохимических целей. Метод замещения льда в тканях в замороженном состоянии, основные принципы. Метилцеллозольв. Использование ацетона в замещении в замороженном состоянии.

МИКРОТОМИЯ ТКАНЕЙ. Что такое микротомия тканей? Толстые и тонкие срезы. Типы микротомии (классификация). Типы микротомов (ротационный, салазочный). Криостат. Резаки и вибратомы. Подготовка ткани для микротомии. Материалы для заливки тканей для микротомии (общая характеристика). Водорастворимые пластмассы (поливиниловый спирт. полиэтиленгликоли). Гелеобразующие заливочные материалы (желатин, агар). Парафин (способы заливки). Заливка ткани в целлоидин. Общая конструкция криостата МК-25. Подготовка ткани для микротомирования в криостате. Общая конструкция салазочного микротома. Общая конструкция ротационного микротома. Замораживающий микротом. Конструкция микротомных ножей.

МАНИПУЛЯЦИИ СО СРЕЗАМИ ТКАНЕЙ. Подготовка предметных и покровных стекол. Основные параметры предметных и покровных стекол (толщина, размеры и др.). Маркировка предметных стекол. Приклеивание срезов к предметным стеклам. Получение срезов на замораживающем микротоме: манипуляции со срезами. Приготовление срезов в криостате: манипуляции со срезами. Изготовление срезов из парафиновых блоков (перенос срезов, расправление срезов и др.). Манипуляции со срезами тканей залитых в целлоидин. Нагревательный столик.

КРАСИТЕЛИ И МИКРОСКОПИЯ ОСНОВЫ ОПТИКИ. Красители в гистохимии (общая характеристика). Взаимодействие света с красителями (общие проблемы). Свет — электромагнитная волна. Что такое длина волны ? Волновое число. Что такое частота электромагнитной волны. Спектр электромагнитных волн, характеристика длин волн и частот для УФ и видимой области спектра. Интерференция и ее использование в микроскопии. Показатель преломления. Фазовые и амплитудные объекты для микроскопирования. Поляризация света и ее использование в микроскопии. Квантовая природа света. Энергия квантов света с длиной волны 200, 300 ….700 нм. Закон Бугера-Ламберта-Беера. Оптическая плотность. Использование закона Бугера-Ламберта-Беера в количественном гистохимическом анализе. Флуоресценция и фосфоресценция. Энергия возбужденных состояний. Правило Стокса. Квантовый выход флуоресценции.Тушение флуоресценции.

Количественный флуоресцентный анализ. Использование флуоресцентной микроскопии в гистохимии. МИКРОСКОПИЯ. Основные элементы светооптического микроскопа. Основы геометрической оптики (линза, плоскость объекта, плоскость изображения, фокус и др.). Хроматическая аберрация. Сферическая аберрация. Астигматизм, кома. Что такое ахроматы, апланхроматы, анастигматы. Оптическое разрешение микроскопа. Апертура объектива. Связь увеличения, апертуры, рабочего расстояния и диаметра поля зрения объективов микроскопов. Оптическая система светооптического микроскопа. Освещение объектов в микроскопах. Увеличение микроскопа (связь с оптическим разрешением). Масляная иммерсия. Оптические свойства биологических микроскопических объектов (клеток и тканей). Общая характеристика методов микроскопии. Метод темного поля. Фазово-контрастная микроскопия. Интерференционная микроскопия. Использование интерференционной микроскопии в гистохимии. Поляризационная микроскопия. Ультрафиолетовая микроскопия (применение в гистохимии). Флуоресцентный микроскоп, устройство, особенности. Использование флуоресцентной микроскопии в гистохимии. КРАСИТЕЛИ. Восприятие цвета глазом человека (белый цвет, монохроматический цвет). Прозрачные и непрозрачные тела (общая характеристика).

Спектральные и дополнительные цвета. Батохромный сдвиг. Гипсохромный сдвиг. Хроматические и ахроматические цвета. Основные характеристики хроматических и ахроматических цветов (цветовой тон, насыщенность, относительная яркость). Оптическое и механическое смешение цветов. Спектральные характеристики красителей (связь с цветностью). Хромофорно-ауксохромная теория цветности органических молекул. Хромофорные группы в красителях. Ауксохромные группы в молекулах красителей. Электронная теория цветности красителей. Энергия возбуждения молекул красителей и органических соединений. Величина энергии возбуждения светом с длиной волны 400 и 760 нм. Структура молекул и их цветность. Энергия возбуждения связей в молекулах с s-электронами (насыщенные углеводороды). Энергия возбуждения связей в молекулах с p-электронами (ненасыщенные углеводороды). Поляризация атомных групп в молекулах красителей (п-электроны). Роль электрон-донорных и электрон-акцепторных групп в молекулах красителей. Ионизация молекул красителей. Компланарность молекул и связь с цветовыми параметрами. Комплексообразование красителей с металлами (протравные красители). Классификация красителей по химической структуре молекул (основные классы красителей).

ТИПЫ ГИСТОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ (Классификация гистохимических реакций)

1. Прямое использование красителей в гистохимии. А м идо-черный 10В — окраска белков. Использование бромфенолового синего. Основные и кислые красители. Базофилия и ацидофилия. Метахромазия. Лаки и хелатные соединения. Выявление нуклеиновых кислот краплаком галлоцианина. Смесь метилового зеленого-пиронина в гистохимии нуклеиновых кислот. Жирорастворимые красители и гистохимия липидов. Красители — Суданы и нильский голубой.

2. Флуорохромы и люминесцентная микроскопия. А кридиновый оранжевый и другие производные акридина в гистохимии нуклеиновых кислот и мукополисахаридов. Прижизненные методы с использованием флуорохромов. Интравитальная микроскопия.

3. Превращение лейкоформ красителей в хромофорные формы. Реактив Шиффа. Реакция Фельгена. Использование реактива Шиффа в гистохимии углеводов (ШИК — реакция). Количественная гистохимия — микрофотометрия.

4. Образование красителей в ходе гистохимической реакции. Азокрасители. Азосочетание и синтез азокрасителей в ходе гистохимической реакции. Использование азокрасителй в гистохимии ферментов. Нафтолы. Выявление фосфатаз при помощи азосочетаний.

5. Соли тетразолия как гистохимические реактивы. С опряженные реакции в гистохимии. Образование формазанов. Использоавание солей тетразолия в гистохимии окислительных ферментов. Реакция Гленнера для выявления активности моноаминоксидазы.

6. Реакции с образованием солей тяжелых металлов. Использование солей тяжелых металлов в гистохимии ферментов (на примере фосфатаз). Выявление щелочной фосфатазы при помощи нитрата кобальта (Реакция Гомори-Такаматчу). Выявление кислой фосфатазы при помощи нитрата свинца (Метод Гомори). Ферроцианид меди и гистохимия холинэстераз.

7. Образование люминесцирующих продуктов в ходе гистохимической реакции. Реакция Фалька-Хилларпа на биогенные амины. Количественная люминесцентная
микроскопия (микрофлуориметрия).

8. Иммуноцитохимия. Общие принципы. Методы иммуноцитохимии. Использование иммуноцитохимии в гистохимии пептидов и белков. Иммуноцитохимия низкомолекулярных соединений. Контроли и артефакты в иммуноцитохимии. Люмнесцентная иммуноцитохимия.

9. Гибридизация mРНК in situ. Основные принципы и методы. Место метода в современной гистохимии. Артефакты и проблемы метода. Изучение локализации синтеза белков в тканях.

10. УФ-микроскопия и микроскопия собственной флуоресценции внутриклеточных соединений, использование в гистохимии.

11. Использование блокаторов химических групп в гистохимии. Проблема артефактов в гистохимии. Контрольные препараты в гистохимии (пример). Микробиохимия — вариант количественной гистохимии. Динамическая гистохимия (кинетика гистохимических реакций).

12. Значение гистохимии в фундаментальных цитологических исследованиях (изучение клеточного метаболизма, клеточного цикла и др.). Гистохимия и медицина (цитопатология, цитодиагностика). Примечание: Данная программа в разные годы чтения лекций в Пущинском Государственном университете претерпевала небольшие изменения. Программа рассчитана на первый семестр магистратуры как спецкурс. Разделы: -Основы оптики-, -Микроскопия- и -Красители- предлагались для амостоятельного изучения магистрантами и обсуждения на семинарах. Наконец, отдельные разделы Микротехники- и -Типы гистохимических реакций- используются для чтения лекций в Пущинском филиале Московского Государственного университета им.  .В.Ломоносова на втором курсе бакалавриата в разделе -Знакомство с экспериментальными методами биологии.

 

+7 (812)

Телефоны отделов продаж:

337-18-93 - отдел моющих средств и хозтоваров-многоканальный.
337-18-94 - отдел ветзоотехники и агрохимии
337-18-95 - отдел лабораторной посуды
337-18-96 - отдел химии и спецодежды
337-18-97 - отдел лабораторного оборудования и приборов

Адреса электронной почты:

him_spb@mail.ru
himsnab.53@list.ru

Адрес:

198095, г. Санкт-Петербург, ул. Швецова, дом 23 (Здание ТЭМП)

© 2009 — «ХИМСНАБ»
Все права защищены

Отказ от ответственности



Создание сайта — «Consepto»
Продвижение сайта — «1 Место»